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前言

化妝品，是指以涂擦、噴灑或者其他類似方法，施用于皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇等人體表面，以清潔、保護(hù)、美化、修飾為目的的日用化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品。化妝品均由復(fù)雜的化學(xué)成分組成，功效成分良莠不齊，種類日益豐富，其表現(xiàn)的功效性可能是多種活性成分與體內(nèi)多靶點(diǎn)結(jié)合的結(jié)果。2021年5月1日正式施行的《化妝品功效宣稱評價(jià)規(guī)范》中第五條明確指出化妝品的功效宣稱應(yīng)有充分的科學(xué)依據(jù)。基于此，尋求客觀、全面、系統(tǒng)的評價(jià)化妝品功效技術(shù)是時(shí)代進(jìn)步所需要的。

斑馬魚皮膚與人皮膚的比較

圖源 | Russo I, Sartor E, Fagotto L, et al. The Zebrafish model in dermatology: an update for clinicians[J]. Discover Oncology, 2022, 13(1): 48.

在化妝品功效評價(jià)的體外方法中，斑馬魚模型是一種新型評價(jià)方法之一。截至目前，我國公開的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中已有利用斑馬魚模型來進(jìn)行功效評價(jià)的方法，以此證明斑馬魚模型在化妝品行業(yè)具有較高的認(rèn)可度。2021年4月9日國家藥監(jiān)局發(fā)布的《化妝品功效宣稱評價(jià)規(guī)范》，使得斑馬魚模型逐漸進(jìn)入大眾視野，成為國內(nèi)外評價(jià)化妝品認(rèn)可度高的方法之一。與其他模式生物相比，斑馬魚有其特有的評價(jià)優(yōu)勢，結(jié)合人體試驗(yàn)、消費(fèi)者使用測試、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)等多維度評價(jià)方法，讓化妝品功效宣稱更有說服力。

2023年3月27日，《中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)》發(fā)表了鄭丹陽、徐夢漪、李淑敏、朱永闖、龔盛昭、蔡麗華、胡翠萍題為"斑馬魚模型在化妝品功效評價(jià)研究中的應(yīng)用進(jìn)展"的綜述論文，該論文闡述了斑馬魚模型在化妝品美白、抗炎、抗氧化等功效評價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)展。

導(dǎo)讀

與其他哺乳動(dòng)物相比，采用斑馬魚模型評價(jià)化妝品功效性，具有獨(dú)特優(yōu)勢。除個(gè)體較小，繁殖能力強(qiáng)，易于飼養(yǎng)；胚胎透明，易于觀察；可用于短期大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行高通量篩選等優(yōu)勢外，斑馬魚與人類基因組具有高度同源性，約占87%，能可靠地模擬和預(yù)測人類生理，呈現(xiàn)出與人類相似的生理學(xué)特征，被科學(xué)界公認(rèn)為是評價(jià)化學(xué)品最敏感的體內(nèi)方法。且斑馬魚皮膚與人類皮膚結(jié)構(gòu)相似，包含基底層、棘層、顆粒層、透明層和表皮角質(zhì)細(xì)胞層，皮膚間質(zhì)結(jié)締組織、膠原及其鄰近的纖維母細(xì)胞及皮膚基因表達(dá)與人類皮膚相似，因此采用斑馬魚評價(jià)化妝品功效具有較大的參考價(jià)值。

1.斑馬魚模型在化妝品美白功效評價(jià)的應(yīng)用 

斑馬魚幼魚透明，其體表有黑色素沉淀，用光學(xué)顯微鏡可直接觀察體表黑色素變化，可直接用于評價(jià)化妝品美白功效，簡化實(shí)驗(yàn)過程。目前，行業(yè)通用的斑馬魚模型評價(jià)美白類化妝品及原料功效的標(biāo)準(zhǔn)，主要為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（表1），表1中團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)采用的評價(jià)原理均為酪氨酸經(jīng)過酪氨酸酶作用，氧化生成多巴，多巴經(jīng)氧化、脫羧等反應(yīng)轉(zhuǎn)變成吲哚醌，最后吲哚醌聚合為黑色素，在斑馬魚體表呈現(xiàn)。

表1全國現(xiàn)行斑馬魚評價(jià)美白化妝品團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

胚胎時(shí)期的斑馬魚通體透明，便于在肉眼下用體視顯微鏡直接觀察拍照，并用圖片分析軟件（如Image J）計(jì)算黑色素含量，比較處理組與對照組的胚胎體表黑色素變化，計(jì)算得出黑色素的抑制效果。該黑色素分布測定法（圖像法）可直觀快速反映出測試樣品的美白效果（如圖1）。

通過圖像法，簡單直觀判別受試物的美白功效，成為眾多研究者研究原料美白功效的方法之一。Park等通過圖像法分析得出，在相同濃度下，與熊果苷（A）相比，金納米粒子（GNPs）-熊果苷作用于斑馬魚胚胎，其頭部和卵黃位置具有較好的美白活性；與熊果苷或苯基β-D-葡萄糖苷（P）相比，GNP-P2表現(xiàn)出更強(qiáng)的美白效果。因此，生物活性糖苷-GNP復(fù)合物可能成為美白化妝品的新方向。張文娟等通過圖像法研究水仙鱗莖醇提取物對斑馬魚胚胎體表黑色素合成的抑制作用。從斑馬魚側(cè)視和俯視位體表區(qū)域比較，在濃度為100、200、500μg/mL的水仙花溶液提取物處理組中，48h和72h斑馬魚胚胎的脊椎及背部黑色素依次遞減，尤其是500μg/mL處理組，黑色素沉著點(diǎn)接近于陽性對照組（200μg/mL的熊果苷，Ar）。通過實(shí)驗(yàn)得出水仙鱗莖醇提取物能夠達(dá)到與熊果苷相似的美白效果。

圖1斑馬魚胚胎體表黑色素觀察部位示意圖

（紅色區(qū)域?yàn)樯販y量區(qū)域） 

此外，T/HPCIA 005-2022團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中還提到另外兩種評價(jià)方法，分別是黑色素生成抑制檢測法和酪氨酸酶活性抑制檢測法。這兩種方法的前處理均為將斑馬魚胚胎破碎離心分層，不同之處在于檢測分層后的混合液，黑色素生成抑制檢測法是取不同濃度受試樣的黑色素沉淀物，在波長為405nm下檢測吸光度值，計(jì)算黑色素含量，進(jìn)而計(jì)算黑色素生成抑制率；酪氨酸酶活性抑制檢測法是取不同濃度受試樣的上清液，在波長為475nm下檢測吸光度，進(jìn)而計(jì)算酪氨酸酶活性抑制率。這兩種方法是從黑色素生成抑制和酪氨酸酶活性抑制的靶點(diǎn)來評判化妝品的美白功效，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)更直觀，適合于利用黑色素生成抑制和酪氨酸酶抑制機(jī)理的美白功效評價(jià)。

為進(jìn)一步探究祛斑美白功效，還可從黑色素形成的信號通路來評價(jià)。調(diào)節(jié)黑色素形成的信號通路與微噬菌體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）有關(guān)，下調(diào)MITF活性可以降低相關(guān)酶的表達(dá)，從而抑制黑色素的形成。Ding等發(fā)現(xiàn)海洋多酚化合物二氯鄰羥基香豆酚（DPHC）能較強(qiáng)地抑制酪氨酸酶活性，其通過減少CAMP依賴蛋白激酶A（PKA）的磷酸化來抑制CAMP響應(yīng)元素結(jié)合蛋白（CREB）的磷酸化表達(dá)，導(dǎo)致MITF表達(dá)水平下降。在斑馬魚體內(nèi)研究中，DPHC顯著抑制斑馬魚胚胎體表黑色素合成，為DPHC在化妝品行業(yè)的應(yīng)用提供參考依據(jù)。根據(jù)化妝品原料美白的作用靶點(diǎn)不同，可選擇對應(yīng)的檢測方法，評價(jià)化妝品美白功效。

2.斑馬魚模型在化妝品抗炎功效評價(jià)的應(yīng)用 

當(dāng)皮膚受到刺激時(shí)，炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）增殖，釋放出炎癥因子，毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加，皮膚出現(xiàn)紅腫、刺痛、瘙癢等癥狀，此稱為炎癥反應(yīng)。炎癥是目前實(shí)驗(yàn)室評價(jià)抗炎功效的指標(biāo)之一。斑馬魚免疫細(xì)胞類型和形態(tài)與人類相似，存在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，使其成為研究炎癥的理想體系。全國現(xiàn)行斑馬魚評價(jià)抗炎化妝品團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)情況如表2所示。

表2全國現(xiàn)行斑馬魚評價(jià)抗炎化妝品團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

對斑馬魚尾部進(jìn)行斷尾處理，可以誘發(fā)斑馬魚尾部局部損傷，促使斑馬魚免疫細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。但成麗等通過切割尾部構(gòu)建巨噬細(xì)胞聚集的轉(zhuǎn)基因斑馬魚（zlyz：EGFP）炎癥模型，以此研究血人參提取物的抗炎活性，結(jié)果顯示：除水層外，血人參提取物不同極性部分——石油醚層和醋酸乙酯層在低濃度下對轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥模型損傷尾部的巨噬細(xì)胞聚集具有顯著的抑制作用。何林燕等主要從巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集和清除情況來表征大麻葉提取物對斑馬魚尾鰭損傷部位抗炎功效，結(jié)果顯示：2.0μg/mL濃度下的大麻葉提取物對斑馬魚尾鰭傷口處的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集有抑制作用，對巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的清除有促進(jìn)作用，且具有顯著性差異，說明大麻葉提取物具有良好的抗炎功效。

此外，過高濃度的脂多糖（LPS）也可引起斑馬魚強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，分泌大量的炎癥因子。倪立穎等研究羊棲菜多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)多酚濃度為200μg/mL時(shí)，NO生成率和ROS生成率分別由202.48%和353.44%降至75.62%和128.91%，并且顯著降低斑馬魚心跳速率和卵黃囊大小。硫酸銅（CuSO₄）誘導(dǎo)的急性炎癥是由于CuSO₄刺激可使斑馬魚免疫細(xì)胞迅速遷移至神經(jīng)丘，而抗炎功效產(chǎn)品可抑制免疫細(xì)胞遷移。Chen等利用斑馬魚胚胎和細(xì)胞模型研究梔子提取物的抗炎活性。研究發(fā)現(xiàn)梔子提取物可有效抑制CuSO₄誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎中原始巨噬細(xì)胞向側(cè)線的遷移；與體外細(xì)胞模型結(jié)果相似，添加梔子提取物處理組降低了LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表達(dá)，且導(dǎo)致nkap的表達(dá)明顯下降，抑制促炎癥細(xì)胞因子上調(diào)。

通過以上3種方法（經(jīng)過斷尾誘導(dǎo)的局部炎癥、脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的全身炎癥和硫酸銅（CuSO₄）誘導(dǎo)的急性炎癥）模擬免疫系統(tǒng)對炎癥的應(yīng)激過程，進(jìn)而評判抗炎功效化妝品的功效性。此外，T/HPCIA006-2022團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中，通過建立斑馬魚刺激模型，也能評估抗炎功效化妝品。實(shí)驗(yàn)方法是采用24hpf斑馬魚胚胎，通過行為學(xué)——自主運(yùn)動(dòng)頻率評估抗炎功效化妝品。通過斑馬魚行為學(xué)評價(jià)，更為直觀反映化妝品的抗炎功效，且該方法較傳統(tǒng)斑馬魚驗(yàn)證模型操作簡單，大大節(jié)省化妝品開發(fā)的實(shí)驗(yàn)成本。

3.斑馬魚模型在化妝品抗氧化功效評價(jià)的應(yīng)用

斑馬魚模型除評價(jià)美白和抗炎功效外，還可用于篩選具有抗氧化功效潛力的化妝品?；钚匝?/span>（reactive oxygen species，ROS）是斑馬魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一，是機(jī)體正常生理活動(dòng)的象征。當(dāng)斑馬魚受到外源物刺激時(shí)，體內(nèi)的ROS含量就會增加，從而導(dǎo)致ROS的自由基代謝異常，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激性損傷。正常情況下斑馬魚體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)ROS含量發(fā)生變化時(shí)，斑馬魚可依靠抗氧化物發(fā)揮作用清除ROS。ROS可被特異性染料檢測，且斑馬魚胚胎透明，使得檢測方法更為便捷。斑馬魚氧化應(yīng)激模型評價(jià)化妝品的抗氧化功效，具有可靠、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。

目前，通常采用2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）、LPS等處理誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激，通過熒光強(qiáng)弱展示ROS產(chǎn)率，進(jìn)而評價(jià)化妝品的抗氧化功效。王杰等將7~9hpf的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度馬齒莧黃酮水溶液1h后，加入15mmol/L AAPH建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)模型，暴露至24hpf后，將所有溶液更換為胚胎培養(yǎng)液孵育至72hpf，此時(shí)胚胎孵化為仔魚，對其進(jìn)行熒光染色1h后，拍照處理計(jì)算得出ROS產(chǎn)生率。結(jié)果顯示，50~300μg/mL的馬齒莧黃酮可顯著降低AAPH誘導(dǎo)后斑馬魚仔魚ROS產(chǎn)生率，說明馬齒莧黃酮具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化功效，為馬齒莧資源的深度開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。萬慶家等采用LPS對斑馬魚胚胎進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，挑選7~9hpf胚胎于不同濃度大麻葉提取物中孵育1h后，加5μg/mL LPS孵育至72h，熒光染色1h后分析計(jì)算熒光強(qiáng)度，得出2.0mg/mL大麻葉提取物顯著抑制ROS產(chǎn)生，熒光強(qiáng)度較弱，證明大麻葉提取物具有潛在的抗氧化功效，可應(yīng)用于化妝品中。

通過建立斑馬魚氧化應(yīng)激模型，結(jié)合胚胎透明優(yōu)勢，利用ROS熒光強(qiáng)度，可直觀反映化妝品的抗氧化功效，且能減少實(shí)驗(yàn)成本。

4.斑馬魚模型在化妝品其他功效評價(jià)的應(yīng)用

 斑馬魚表皮滲透壓超過耐受范圍時(shí)，皮膚將發(fā)生脫水現(xiàn)象，且斑馬魚皮膚結(jié)構(gòu)與人體相似。因此，采用高滲透溶液建立斑馬魚補(bǔ)水保濕的誘導(dǎo)模型，能夠模擬評價(jià)補(bǔ)水保濕功效化妝品性能。周示玉等將2dpf斑馬魚置于不同濃度受試物中，孵育18h后對比斑馬魚尾部面積大小，以此評價(jià)甘油葡糖苷補(bǔ)水保濕功效，結(jié)果表明甘油葡糖苷具有良好的補(bǔ)水保濕功效。陳金龍等采用72hpf野生型斑馬魚仔魚置于不同濃度受試物中，孵育15min后對比滲透前后尾部長度變化，計(jì)算得出斑馬魚尾部長度收縮率，結(jié)果表明1%濃度下的三款面膜均有潛在的保濕功效。采用斑馬魚胚胎評價(jià)化妝品補(bǔ)水保濕功效，可大大降低實(shí)驗(yàn)成本，且實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)，可廣泛推廣。

斑馬魚傷口皮膚愈合迅速，尾鰭再生是研究組織修復(fù)的一種特別有效的模型，因此，可用斑馬魚尾鰭再生模型評價(jià)化妝品修護(hù)功效。楊娟等采用3d野生型斑馬魚胚胎，切除尾鰭后暴露于不同濃度受試物中，暴露48h后對胚胎進(jìn)行拍照分析，結(jié)果表明6%濃度下的二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞物（Ferment-DFL）對斑馬魚胚胎尾鰭修護(hù)促進(jìn)率達(dá)15%，說明Ferment-DFL具有促進(jìn)修護(hù)功效，可廣泛應(yīng)用于護(hù)膚品中。

斑馬魚肥大細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能與人類相似，可參與機(jī)體的免疫和過敏反應(yīng)。N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽（BAPNA）是胰蛋白酶（Tryptase）特異性底物，可以檢測斑馬魚體內(nèi)的Tryptase表達(dá)水平，定量分析化妝品的抗過敏功效。萬慶家等采用3dpf斑馬魚，先后加入相同體積的不同濃度庫拉索蘆薈花提取物、Compoud48/80、BAPNA溶液中，各孵育1h，使用酶標(biāo)儀檢測吸光值（OD405），以此計(jì)算Tryptase表達(dá)水平和抑制率。結(jié)果表明，0.1%~0.4%的庫拉索蘆薈花提取物能顯著抑制Tryptase分泌量，具有潛在的抗過敏功效，為其在化妝品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

除以上評價(jià)化妝品功效方法外，仍有其他化妝品功效評價(jià)方法有待開發(fā)，結(jié)合斑馬魚自身優(yōu)勢，評價(jià)化妝品不同功效性能，有利于化妝品高質(zhì)量發(fā)展。

結(jié)語：在“顏值經(jīng)濟(jì)”社會大背景下，消費(fèi)者對功效化妝品的需求在逐年增加。由此可見，功效化妝品的研發(fā)具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＭ瑫r(shí)，也需規(guī)范功效化妝品市場，讓功效宣稱與實(shí)際功效效果相對應(yīng)，保障消費(fèi)者權(quán)益。斑馬魚模型不僅能用于篩選優(yōu)化功效成分的組方和配比，還可優(yōu)化功效產(chǎn)品配方和工藝，從功效成分源頭進(jìn)行評價(jià)篩選，為后期成品功效性能奠定基礎(chǔ)。目前，化妝品功效宣稱種類繁多，而斑馬魚模型評價(jià)化妝品功效規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)，還在逐步建設(shè)和完善。因此，規(guī)范斑馬魚模型評價(jià)化妝品方法，完善相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，是化妝品行業(yè)及科學(xué)研究迫切所需。將斑馬魚模型與體外實(shí)驗(yàn)、人體試驗(yàn)等評價(jià)手段相結(jié)合，能為深入開展化妝品研究提供更為可靠、快速、有效的方法體系。

廣東省綠色日用化工工程技術(shù)研究中心鄭丹陽為該論文第一作者，廣州番禺職業(yè)技術(shù)學(xué)院徐夢漪教授為該論文通訊作者。