雜志：Journal of Bone and Mineral Research
影響因子：6.2（2022-2023）
年份：2018
通訊作者：Bj?rn Busse
通訊作者單位：Department of Osteology and Biomechanics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Lottestr. 55A, 22529 Hamburg, Germany.
摘要
絕大多數(shù)成骨不全(OI)患者的過度骨骼變形和脆性骨折是骨質量大幅下降的結果。由于骨的力學能力依賴于小長度尺度的組織特征，因此評估骨成骨不全在骨的微納米尺度上的表現(xiàn)是至關重要的。在這種背景下，吉娃娃(Chi/+)斑馬魚在I型膠原蛋白α1鏈中攜帶雜合甘氨酸取代，最近被提出作為經典顯性成骨不全的合適動物模型，表現(xiàn)出骨骼畸形，礦化模式改變，體型較小。
本研究使用顯微計算機斷層掃描(micro-CT)、組織形態(tài)學測量、定量背散射電子成像、傅里葉變換紅外光譜、納米壓痕和x射線顯微鏡評估了Chi/+在多個長度尺度上的骨質量特性。在骨骼水平上，Chi/+顯示出較小的身體尺寸、畸形和肋骨中的骨折愈傷組織。全骨水平形態(tài)學變化表明，Chi/+椎體尺寸較小，厚度較小，形狀扭曲。在組織水平上，與野生型斑馬魚相比，Chi/+表現(xiàn)出更高的礦化程度、更低的膠原成熟度、更低的礦物質成熟度、改變的成骨細胞形態(tài)和更低的骨細胞腔隙密度。Chi/+骨的細胞、組成和結構特性的改變可以解釋局部力學特性受損，從而促進Chi/+整體骨脆性的增加。因此，Chi/+骨質量的定量評估進一步驗證了該突變體作為反映與人類經典顯性成骨不全相關的骨特征的重要模型。
關鍵詞：骨組織形態(tài)計量學；遺傳動物模型；骨基質；成骨不全癥。
介紹
成骨不全癥(Osteogenesis imperfecta, OI)是一種骨骼和結締組織的遺傳性疾病，其發(fā)病率約為萬分之一，對骨骼生長和骨礦化具有多重影響?；疾」堑臋C械完整性經常嚴重受損，導致骨脆弱性增加。因此，患者遭受過度的骨骼變形和多發(fā)脆性骨折。在絕大多數(shù)成骨不全患者中，骨折抵抗能力受損是由于負責合成I型膠原蛋白(骨的有機框架)的基因發(fā)生顯性突變。這導致了有機基質結構的減少，伴隨著礦化的延遲，從而延緩了骨骼的生長和成熟。
疾病的嚴重程度可根據成骨不全的類型而有所不同。在影響I型膠原蛋白基因的顯性突變中，I型成骨不全是最輕微和最常見的形式，其表型包括兒童開始走路時發(fā)生的自發(fā)性骨折、輕微畸形、幾乎正常的身材和輕度骨脆性。最嚴重和致命的形式是II型，胎兒經歷子宮內骨折和出生前死亡。中間類型是III型，嚴重表型包括骨折、脊柱側凸、嚴重變形和身材非常小，以及IV型，中度表型包括骨折和身材小。
由于這些類型的成骨不全通常在骨骼和全骨水平表現(xiàn)為低骨量并骨折或畸形，因此最初的診斷方法通常采用x線吸收儀和x線攝影。根據患者的骨活檢，在骨的微觀和納米尺度上進一步在組織水平上表征成骨不全，觀察到超微結構的改變與成骨不全的臨床嚴重程度密切相關。對于I型至IV型成骨不全的組織，有報道稱其在亞微米尺度上的力學行為受損，存在不規(guī)則的高礦化區(qū)域，以及納米級骨成分(膠原原纖維和羥基磷灰石晶體)結構的變化。由于骨在小長度尺度上的材料特性決定了骨在全骨和骨骼水平上的力學能力，因此評估成骨不全以何種方式損害骨組織質量至關重要。然而，目前的治療方案主要是通過增加整體骨量來增加骨強度。因此，包括肌肉骨骼運動在內的常規(guī)措施經常與廣泛基于抗吸收雙磷酸鹽治療的藥理學方法相結合。然而，考慮到成骨不全癥患者的年齡范圍特別大，臨床變異性和遺傳多樣性也很大，這種治療方法的成功與否往往尚無定論。
因此，為了更好地了解該疾病對所有骨骼長度尺度的影響，并加快尋找脆性骨病的強化治療方案，已經建立了大量的動物模型并進行了表征。除了研究得很好的哺乳動物模型，包括老鼠和狗，新的小型動物模型正在出現(xiàn)。斑馬魚(Danio rerio)因其發(fā)育時間短、與人類遺傳相似、體型小、養(yǎng)殖成本低等特點，已成為生物醫(yī)學研究領域有價值的動物模型。在OI和類似的遺傳性骨骼疾病的背景下，迄今為止很少有斑馬魚突變被產生并表征骨骼表型。Fisher等人首先描述了吉娃娃(Chi/+)斑馬魚的顯性G574D突變，該突變影響編碼I型膠原α1鏈的col1a1a基因，因此與嚴重的顯性人類OI具有遺傳相似性。在α1(I)中攜帶甘氨酸取代，這些斑馬魚在骨骼生長和成熟方面存在缺陷和遲緩。最近，Gioia等人對Chi/+的骨骼表型進行了更全面的描述，他們通過對固定和體內樣本進行特異性骨染色，證實了嚴重的骨骼畸形和延遲礦化，從而支持Chi/+突變體作為經典顯性成骨不全的有希望模型的適用性。
為了擴大Chi/+作為人類OI模型的有效性，我們需要與健康對照相比，關于病變骨骼的組織和生物力學特征的進一步數(shù)據。本研究的目的是提供Chi/+斑馬魚在骨骼形態(tài)、脆性、結構和成分以及細胞和機械特性方面的變化的定量數(shù)據。采用多模態(tài)技術陣列從宏觀到納米尺度比較Chi/+和野生型斑馬魚的骨骼，以檢驗以下假設:Chi/+斑馬魚的骨骼材料特性的損害是導致骨骼脆性增加的原因，如對人類OI的描述。
材料和方法
吉娃娃魚(Chi/+， col1a1adc124/+)和野生型AB (WT)斑馬魚在意大利帕維亞大學放射生物學研究中心進行室內飼養(yǎng)。突變體Chi/+在col1a1a中攜帶G2207A突變，導致I型膠原α1鏈中的G574D雜合替代。Gioia等人詳細描述了斑馬魚的飼養(yǎng)、繁殖和飼養(yǎng)條件。幼蟲體內骨形成特征已被量化;對成年斑馬魚進行了離體骨組織表征，該斑馬魚在10月齡時被處死，并在-80°C冷凍保存。
幼蟲動態(tài)骨組織形態(tài)測定
在幼蟲期進行動態(tài)骨組織形態(tài)學測定，以量化突變對椎組織骨形成率(BFR)的影響。在受精后8天(dpf)和10天(dpf)，使用0.2%鈣黃蛋白作為重要染料對WT和Chi/+斑馬魚的鈣化骨進行染色(每組n=6)。簡單地說，將幼蟲在溶液染料中轉移10分鐘，并用胚胎水洗滌。顯微鏡成像根據既定方法確定椎體中心2、3和4的面積。通過測量每個椎體在10 dpf和8 dpf時量化的椎體面積之間的比率來確定BFR。
整體骨架染色
為了表征成人骨骼骨折，按照Gioia等人的描述，對WT (n?24)和Chi/+ (n?29)斑馬魚的軟骨和骨進行了阿利新藍和茜素紅染色。簡單地說，將魚固定在4%磷酸鹽緩沖的多聚甲醛溶液中，去鱗和內臟，用丙酮脫脂，并用0.02%阿利新藍8GX染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)。去除軟組織后，用0.01%茜素紅S (Sigma Aldrich)染色。圖像采集使用徠卡M165 FC顯微鏡(徠卡，Wetzlar，德國)連接到徠卡DFC425 C數(shù)碼相機。存在于肋骨中的愈傷組織由三名獨立的觀察者進行量化，對魚的基因型不知情。
微型計算機斷層掃描(Micro-CT)
使用5μm空間分辨率的微型計算機斷層掃描(micro-CT)評估骨骼形態(tài)和骨微結構(Skyscan 1272, Bruker, Kontich, Belgium)。每組6條魚在3.5%福爾馬林中固定24小時，掃描時放置在潮濕的箱中。在55kv和166μA下進行全身掃描，不使用x射線濾光片。在NRecon (Bruker, Kontich, Belgium)的重建過程中，所有樣品的環(huán)形偽影和光束硬化校正保持不變。在對所有樣本應用固定閾值后，使用CTAn (Bruker, Kontich, Belgium)進行3D評估。在每只魚的第一和第二前椎骨上量化Chi/+和WT的骨形態(tài)變化。神經弓和血管弓被排除在分析之外。確定的參數(shù)為椎體長度(VL, μm)、椎體厚度(V.Th, μm)、偏心率(Ecc, 0-1)和骨體積(BV, mm3)，定義為沒有內腔的椎體。
傅里葉變換紅外光譜學
利用傅里葉紅外光譜分析了礦物相和膠原相的組成。每組6只斑馬魚在3.5%福爾馬林中固定24小時，隨后在增加濃度的乙醇中逐步脫水，然后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。樣品塊被拋光共面用于組織成分分析，其中在外側平面切割的前椎體終板被選擇為感興趣的區(qū)域。使用FTIR光譜(Spotlight 400連接到Frontier 400, perkins - elmer, Waltham, MA, USA)以衰減全反射(ATR)模式掃描Chi/+和WT椎骨。獲得尺寸為65μm ×130μm的地圖，空間分辨率(像素大小)為1.56μm，每像素掃描8次，波數(shù)范圍為4000 ~ 570 cm-1。使用自定義編寫的Matlab腳本(R2016b, MathWorks, Natick, MA,USA)進行后處理和光譜分析，包括PMMA信號的減法，吸光度信號的平滑和線性基線的去除。根據原始光譜的二階導數(shù)識別出感興趣的峰。磷酸鹽峰位于1154 ~ 900 cm-1之間，碳酸鹽峰位于870 cm-1中心，酰胺I峰位于1710 ~ 1600 cm-1中心。通過劃分各自的峰面積來確定骨組織參數(shù)，包括膠原成熟度(酰胺I亞峰1660/1690 cm-1)、碳酸鹽-磷酸鹽比(碳酸鹽/磷酸鹽面積)、結晶度(磷酸鹽亞峰面積1028/1018 cm-1)和礦物-基質比(磷酸鹽/酰胺I面積)。
定量背散射電子成像(qBEI)
為了分析Chi/+和WT斑馬魚的前椎椎骨的骨密度分布，我們對相同的樣品和相同的感興趣區(qū)域進行了電子成像，就像之前用FTIR光譜分析的那樣。在成像之前，樣品被碳涂層。掃描電鏡觀察每組6個標本(LEO 435 VP;LEO Electron Microscopy Ltd, Cambridge, UK)在20kv和680 pA下工作，恒定工作距離為20mm(瘋牛病探測器，202型;K.E.發(fā)展有限公司，劍橋，英國)。根據先前描述的方案確定灰度值圖像上的骨礦物質密度分布。使用碳鋁標準對系統(tǒng)進行校準，便于骨礦物質作為鈣重量百分比的定量。測定的參數(shù)包括平均鈣含量(caamean, wt%)、骨礦物質分布的異質性(CaWidth, △wt%)和高度礦化骨的面積(CaHigh，%B.Ar.)。
納米壓痕
用納米壓痕分析了Chi/+和WT中椎組織的納米力學性能。每組4個共面PMMA包埋的樣品用3μm的金剛石懸浮液拋光，然后用1μm的金剛石懸浮液拋光，最后用0.05 μm的氧化鋁懸浮液拋光，以降低表面粗糙度。為了去除表面碎屑，樣品在去離子水中進行超聲清洗。使用配備Berkovich鉆石尖端的納米壓痕器(Nano壓痕器G200, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)對每個樣品的兩個椎骨進行8個壓痕。在深度傳感連續(xù)剛度模式下進行壓痕，最終深度為500 nm。在每次測量之前和之后對熔融石英進行校準。凹痕的位置至少間隔20μm。在泊松比為0.3的情況下，使用內部軟件(NanoSuite, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)，根據olive - pharr方法獲得彈性模量(E)和硬度(H)。此外，計算了彈性模量與硬度的比值，作為斷裂韌性的替代指標。
靜態(tài)骨組織形態(tài)測定
通過靜態(tài)骨組織形態(tài)測量法評估成人WT和Chi/+的細胞和組織特征。如上所述，將魚包埋在PMMA中(n=4/組)。用切片機沿脊柱制作4毫米厚的矢狀切片，隨后用甲苯胺藍染色。使用Ostemeasure組織形態(tài)測量系統(tǒng)(OsteoMetrics, Atlanta, GA, USA)測定骨細胞和組織指數(shù)。提取以下參數(shù):每骨周成骨細胞數(shù)(N.Ob/B;Pm, 1/mm)，每骨體積的骨表面積(BS/BV, mm2/mm3)，每骨體積的類骨體積(OV/BV，%)，以及每骨面積的骨細胞腔隙數(shù)量(N.Ot/B.Ar,1/mm2)。在20倍放大鏡下對每條魚的兩個椎骨進行評估。
三維x射線顯微鏡
使用x射線顯微鏡(3D XRM, ZEISS Xradia 520 Versa, Carl ZEISS x射線顯微鏡，Pleasanton, CA, USA)進一步觀察Chi/+和WT椎組織中的骨細胞腔隙網絡。從新鮮冷凍動物上解剖椎體，仔細去除周圍軟組織，將樣品脫水并以0.75μm的空間分辨率掃描。重建后，使用3貶值軟件對椎體進行分析(Visual SI Advanced, Object Research Systems Inc, Montreal, Canada;ImageJ2 v1.5, https://imagej.nih.gov/ij)。
統(tǒng)計分析
使用SPSS (Version 24, IBM, Armonk, NY, USA)進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性檢驗采用Levene檢驗。組間比較采用獨立樣本t檢驗，p < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果以平均值±SD表示。
幼蟲成骨率
為了量化先前描述的Chi/+中骨形成的延遲，在8和10 dpf時對突變體和WT幼蟲進行鈣黃蛋白生命染色(圖1A)。在評估了V2、V3和V4椎體中心礦化面積的比例(10 dpf vs 8 dpf)后，與WT相比，Chi/+中三個椎體的骨形成明顯較低(圖1B)。在V2和V3中，Chi/+的比值呈較小的趨勢，在VB4中達到顯著性(0.9±0.1比1.1±0.1,p< 0.05)。
成人骨折特征
對魚進行茜素紅和阿利新藍全載染色，可以量化成年Chi/+和WT斑馬魚肋骨中愈傷組織的數(shù)量(圖1C-E)。骨折愈傷組織是根據其圓形/橢圓形形態(tài)和深藍色染色來識別的，這使得它們與染色過程中由制備人工制品引起的骨折區(qū)分開來，后者的特征是骨骼清晰切割(圖1D)。盡管59%的突變體表現(xiàn)為骨折愈傷組織(25%為單個愈傷組織，34%為兩個或更多)，但8%的WT魚表現(xiàn)為單個愈傷組織(圖1E)。值得注意的是，在染色過程中處理的骨折數(shù)量Chi/+(96%為多處骨折)比WT(38%單處骨折)高得多。
圖1 野生型(WT)斑馬魚和Chi/+斑馬魚在骨骼水平的表型差異。與野生型相比，Chi/+在幼蟲期延遲了骨骼生長(A,B)，而在成年Chi/+中增加了骨脆性(C,D)。(A)在WT和用鈣黃綠素標記的Chi/+幼蟲的三個椎體(V2, V3, V4)上評估骨形成。以受精后10天(dpf)的椎體面積除以受精后8天(dpf)的椎體面積來確定椎體面積比，作為骨形成率的衡量指標。(B)與WT相比，Chi/+斑馬魚的椎體面積比率顯著降低。(C)成年Chi/+斑馬魚用阿利新藍和茜素紅進行了整塊染色。(D)肋骨骨痂(紅色箭頭)和染色過程中處理引起的骨折(黑色箭頭)的放大。(E) WT和Chi/+魚的骨折愈傷組織百分比。59%的Chi/+魚和8%的WT魚肋骨處有骨折痂。
骨骼形態(tài)學和全骨結構
Chi/+和WT斑馬魚的顯微ct三維重建顯示，兩組之間在宏觀骨骼形態(tài)和礦化方面存在實質性差異(圖2A, B)。Chi/+斑馬魚的體型與WT相比顯著減小，標準長度為15.9±0.5 mm，而WT為22.5±1.8 mm (p< 0.001)。隨著骨折愈傷組織和肋骨的變形，Chi/+斑馬魚的骨骼器官呈現(xiàn)非均勻礦化，這是x射線吸收的差異所表明的。在全骨水平上，特別是在Chi/+斑馬魚的脊柱沿線，觀察到高礦化區(qū)域與低礦化區(qū)域直接相鄰:尾前和尾側區(qū)域的高礦化和融合椎骨位于兩者之間的低礦化脊柱區(qū)域旁邊。
與野生型斑馬魚相比，Chi/+斑馬魚的椎體顯著較小，椎體長度顯著較低，分別為288±44μm和488±52 μm, p < 0.001(圖2C);椎體厚度顯著較低，分別為13.5±1.0 μm和17.2±0.8μm, p < 0.001(圖2D)。值得注意的是，Chi/+的前椎體經常呈現(xiàn)礦化核心(圖2B，右)，這被排除在形態(tài)計量學評估之外。盡管兩組椎體的偏心率(圓度)相似(圖2E)， Chi/+斑馬魚的BV顯著降低，為0.004±0.001 mm3，而WT對照組為0.008±0.001 mm3, p < 0.001(圖2F)。
圖2 通過微型計算機斷層掃描(micro-CT)觀察Chi/+和野生型(WT)斑馬魚椎骨的骨骼形態(tài)和結構。(A)成年野生斑馬魚的典型全身掃描(左)和典型雙錐幾何結構的孤立前椎體(中)。形態(tài)測量參數(shù)顯示在椎體的縱向切割(右)。(B) Chi/+突變體的代表性全身掃描(左)顯示顱骨和脊柱內的不均一礦化，肋骨和鰭的畸形，以及融合或塌陷的椎骨。Chi/+突變體的椎體顯示出異常的幾何形狀(中心)，其核心有礦化硬組織的積累(右)。前段椎體的形態(tài)測量分析顯示(C) Chi/+中椎體長度(VL)顯著減小，(D)椎體厚度(V.Th)顯著減小，(E)偏心度相似，(F)骨體積(BV)減小。
組織成分和成熟度
通過FTIR光譜分析Chi/+和WT斑馬魚椎骨的骨組織成分，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)膠原蛋白和礦物質相關參數(shù)存在顯著差異(見圖3A-D)。Chi/+組的膠原成熟度比明顯低于toWT組，分別為10.1±5.8和24.2±5.7,p < 0.001 3(圖3A)。Chi/+斑馬魚的碳酸鹽與磷酸鹽比率顯著高于WT，分別為0.092±0.002和0.089±0.002, p < 0.01(圖3B)，參數(shù)結晶度(衡量晶體成熟度和大小)顯著低于WT對照組，分別為11.5±1.6和20.1±6.3，p=0.005(圖3C)。在Chi/+中，礦物與基質的比值略高(圖3D)。
圖3 利用傅里葉變換紅外光譜評估野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的前椎體組織成分。感興趣的區(qū)域對應于兩個椎體之間的椎終板區(qū)域。(A)Chi/+突變體中膠原成熟度顯著降低。(B)在Chi/+中，碳酸鹽與磷酸鹽的比率(晶格中碳酸鹽取代的量度)明顯更高。(C)結晶度，衡量礦物晶體大小，晶格純度和晶體年齡，在Chi/+突變體中顯著降低。(D)與WT相比，Chi/+的礦物與基質比率呈現(xiàn)出更高的趨勢(p = 0.196)。插圖顯示了整個椎骨的代表性光譜圖。請注意，與Chi/+中改變的結構相比，WT中典型的雙錐形狀，包括Chi/+中的礦化核心，與WT和Chi/+中的皮質殼(紅色像素)相比，其礦物與基質的比率較高(黃色像素)。
骨密度分布
定量背散射電鏡獲得的骨礦物質密度分布顯示，Chi/+和WT對照組的礦化模式存在明顯差異(圖4A-E)。如圖4B所示，鈣在Chi/+中的分布向高濃度轉移。Chi/+的平均鈣重量百分比(caman)明顯高于WT，分別為27.8±0.8 WT %和26.7±0.9 WT %， p = 0.039(圖4C)。在組織水平上，各組間礦化的異質性(CaWidth)相似，如圖4D所示。Chi/+和WT高鈣區(qū)(CaHigh)差異無統(tǒng)計學意義(12.1%±8.1% B.Ar.和5.0±2.9% B.Ar.)(圖4E)。
圖4 通過定量背散射電子顯微鏡評估野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的骨密度分布。(A)兩個相鄰椎體的終板區(qū)域附近的骨皮質在Chi/+和WT之間的礦化程度有顯著差異。在Chi/+椎體的中心，經常出現(xiàn)不均勻的礦化核心(插圖，箭頭)。(B)椎體終板區(qū)域顯示，與野生型相比，Chi/+斑馬魚的礦物質含量更高。Chi/+斑馬魚的平均骨密度分布明顯向更高的值偏移。(C)與WT相比，Chi/+中的平均鈣含量(CaMean)顯著升高。(D)與WT相比，Chi/+中的礦化異質性(CaWidth)沒有變化，并且(E) Chi/+中含有高度礦化骨的區(qū)域(CaHigh)顯示出向高度礦化骨區(qū)域的趨勢(p = 0.092)。
局部力學性能
納米壓痕顯示了Chi/+和WT斑馬魚椎骨組織的不同力學特性(圖5A-D)。結果顯示，與WT斑馬魚椎骨相比，Chi/+的彈性模量明顯較低，分別為21.2±0.8 GPa和24.7±1.8 GPa, p=0.02(圖5B)。兩組之間的硬度無顯著差異，分別為0.96±0.03 GPa和0.94±0.08 GPa(圖5C)，而Chi/+的彈性模量與硬度之比明顯低于WT，分別為22.9±1.1和26.3±0.3,p=0.002(圖5D)。
圖5 野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的局部力學特性。(A)電鏡圖像顯示，在椎體終板附近礦化皮質骨中存在納米壓痕。插頁顯示縮進的印記(箭頭)。(B)椎體的納米壓痕顯示了組織局部力學特性的差異。彈性模量(E)，衡量材料的剛度，在Chi/+中顯著降低。(C)組織硬度(H)在Chi/+和WT之間沒有差異。(D)彈性模量與硬度之比(斷裂韌性的替代指標)在Chi/+中明顯較低，表明骨折風險較高。
骨形成和骨細胞特征
感興趣的組織學區(qū)域的概述見圖6A。在Chi/+和WT的甲苯胺藍染色切片上進行靜態(tài)骨組織形態(tài)測定，可以測定骨細胞和組織指數(shù)(圖6B-F)。如圖6B所示，組織學切片支持Chi/+中存在結構差異和較小的椎體大小。在細胞指數(shù)方面，Chi/+突變體在矢狀切片(箭頭)表現(xiàn)出較少的骨細胞數(shù)量。關于立方體的形狀。Chi/+與WT相比，每骨周成骨細胞數(shù)量(N.Ob/B.Pmr)有更高的趨勢，分別為10.3±2.3細胞/mm和7.6±0.8細胞/mm, p=0.069(圖6C)。Chi/+的骨表面積/骨體積(BS/BV)高于WT，分別為103.4±12.0 mm2/mm3和82.5±9.7 mm2/mm3, p = 0.057(圖6D)。與WT相比，Chi/+中發(fā)現(xiàn)了類骨體積/骨體積(OV/BV)反映的類骨積累趨勢(0.49±0.23%比0.24±0.06%，p =0.111)(圖6E)。Chi/+組的骨細胞數(shù)量(N.Ot/B.Ar)明顯低于WT組，分別為496±151細胞/mm2和883±242細胞/mm2, p = 0.034(圖6F)。
椎體的三維形狀和骨細胞腔隙網絡
使用x射線顯微鏡評估Chi/+和WT椎體中的骨細胞腔隙網絡，并允許可視化雙錐狀椎體中的骨細胞腔隙。如圖6G所示，兩組骨細胞在椎終板附近呈同心分布，在椎體狹窄的椎體中呈軸向分布。腔隙孔的目視檢查在兩組之間有明顯的差異。與WT相比，Chi/+中骨細胞腔隙密度降低。與Chi/+相比，WT中存在更多體積約為500 μm3的增大腔隙(紅色)。
圖6 (A)野生型斑馬魚脊椎解剖概述。上圖:示意圖顯示相鄰的椎體，包括典型的雙錐狀礦化骨(深灰色)，椎體內空泡狀脊索組織(淺灰色)，以及包括椎間韌帶(IVL)在內的椎間生長區(qū)域(圈)。圖中:von kossa染色切片的組織學概述:礦化骨(黑色)，空泡脊索組織(橙色)，包括骨樣縫的椎間盤區(qū)域(紅粉色)。下圖:甲苯胺藍染色切片的組織學概述圖像顯示礦化骨(淺紫藍色)，不同染色強度的空泡脊索組織，以及包括韌帶在內的綠松石色椎體生長區(qū)域。(B)對于組織形態(tài)學，對WT和Chi/+的甲苯胺藍染色切片的高倍圖像進行分析，允許在終板區(qū)域(即生長區(qū)域)內可視化和測量類骨細胞和成骨細胞。圖像顯示骨細胞(箭頭)嵌入礦化骨基質中，成骨細胞(Ob)位于椎骨表面。虛線表示脊索軟組織與礦化骨的邊界。Chi/+中椎體終板的形態(tài)與WT不同，包括更大的椎間隙，扭曲的幾何形狀，以及椎間韌帶附近深色纖維組織的積累。生長區(qū)域的典型特寫圖(下圖)顯示成骨細胞位于WT中厚度<1 μm的淺藍色類骨接縫上(箭頭)。與WT相比，Chi/+組織呈現(xiàn)出更厚的類骨層(平均大于1 μm)和更立方體形狀的成骨細胞的趨勢。(C)每骨周成骨細胞數(shù)(N.Ob/B.Pm)顯示Chi/+與WT相比有更高數(shù)量的趨勢(p = 0.069)。(D) Chi/+與WT相比，每骨體積的骨表面積(BS/BV)有更高的趨勢(p = 0.057)。(E)與WT相比，每骨體積的類骨體積(OV/BV)顯示Chi/+有類骨堆積的趨勢(p = 0.111)。(F) Chi/+中每個骨面積的骨細胞數(shù)量(N.Ot./B.Ar)明顯低于WT。(G) Chi/+和WT椎體的三維x射線顯微鏡圖像，空間分辨率為0.75 μm。雙錐體形狀在WT和Chi/+中是明顯的，而骨細胞腔隙體積及其分布的差異是突出的。腔隙在椎終板附近呈同心分布，在斑馬魚椎體狹窄的椎體中呈軸向分布。與WT相比，Chi/+的骨細胞腔隙網絡不太明顯。
討論
通過顯微ct、FTIR光譜、qBEI、納米壓痕、組織形態(tài)計量學和x射線顯微鏡等一系列骨質量分析，本研究揭示了在I型膠原蛋白α1鏈中攜帶雜合甘氨酸替代的OI斑馬魚模型的骨質量變化。突變引起的骨質量改變在所有研究的骨骼部位都有表現(xiàn):從全骨到組織水平。
幼年期Chi/+和WT的動態(tài)骨組織形態(tài)測量顯示，Chi/+斑馬魚模型的骨形成延遲，這與之前的觀察結果一致。在Chi/+和WT斑馬魚的成年骨骼上進行的三維形態(tài)測量進一步驗證了最近在Chi/+斑馬魚模型上進行的放射學和組織學調查中描述的骨骼畸形的存在。與人類成骨不全類似，這些異常同時存在于軸骨和尾骨。聚焦于椎體，本研究顯示骨體積大幅減少，椎骨皮質殼更薄，這與人類I型至IV型成骨不全癥病例的臨床觀察結果完全一致。有趣的是，椎體的偏心率(它們的圓度)不受突變的影響，這表明Chi/+斑馬魚的橫向運動模式不會導致脊柱沿線全骨水平的永久性畸形。然而，Chi/+斑馬魚在第一尾前椎骨和尾中椎骨中表現(xiàn)出明顯的椎體特征，其中包含一個非典型的礦化核心。與皮質椎體區(qū)域(深色像素)相比，整個前椎體中礦物質與基質的比例分布表明，礦化核心(明亮像素)中磷酸鹽與酰胺I的比例較高(圖3D，插圖)。這表明該區(qū)域的礦化程度較高或膠原蛋白含量較低。尾前椎骨相同區(qū)域的qBEI圖像(圖4A，插圖)顯示，與皮質區(qū)域相比，核心區(qū)域的礦物質分布高度不均勻，鈣含量較低(深色像素)。對這些數(shù)據集的綜合評估表明，椎體核心的礦化組織似乎是一種異質性的、低礦化的、膠原蛋白含量低的組織。
在人類成骨不全的病例中，已確定多處椎體骨折的積累會導致進行性脊柱畸形。因此，觀察到的Chi/+斑馬魚脊柱變形也可能與骨折史有關。在臨床環(huán)境中，包括骨折和畸形在內的大量宏觀異常通?？梢愿鶕跋駥W指征來識別成骨不全。然而，這種方法還不足以作為可靠的骨折風險評估的基礎，因為健康和病理骨的力學能力是由組織水平的材料特性決定的。在這種情況下，成骨不全小鼠模型在很大程度上有助于將成骨不全影響骨的力學特性與微觀長度尺度上的超微結構缺陷聯(lián)系起來，從而更好地理解OI相關脆性的起源。
在這項對攜帶α1-G574D突變的斑馬魚進行的研究中，結構和成分分析顯示，有機膠原基質和無機礦物晶體相在Chi/+椎骨中均受到顯著影響。正如振動光譜所證明的，膠原基質的分子結構在Chi/+斑馬魚中顯著不同。雖然光譜分析中使用的膠原相關亞峰位置和比率還沒有通過生化分析(如高效液相色譜)與斑馬魚骨中的膠原I分子相關，但我們發(fā)現(xiàn)，已建立的膠原成熟度比率(1660/1690 cm-1)在Chi/+中對較低的膠原成熟度產生了顯著差異。這一參數(shù)的改變被認為與經典顯性OI中異常的膠原纖維形成和結構有關，這被認為包括隨后基質中的礦物晶體成核。
事實上，這項研究中評估的礦物相關參數(shù)在Chi/+斑馬魚中受到了影響。盡管OI患者表現(xiàn)為骨密度和骨量降低，但OI的礦化模式在整個骨骼中可能具有高度異質性。因此，據報道，在小鼠OI模型和人類OI模型中，組織水平的礦化程度增加。類似地，Chi/+斑馬魚的鈣含量升高，而羥基磷灰石顆粒的礦物結晶度顯著低于WT。通過振動光譜評估的參數(shù)結晶度與骨中羥基磷灰石晶體的成熟度、大小和純度相關，因此表明Chi/+斑馬魚中的晶體更小、化學計量更少。此外，Chi/+斑馬魚顯示出較高的碳酸鹽/磷酸鹽比率，支持晶體晶格組成中較高的碳酸鹽取代，因此晶體成熟度較低。斑馬魚中的這些發(fā)現(xiàn)與之前在小鼠OI模型和ⅰ~ⅳ型OI的人類組織中觀察到的結果一致，提示受累組織的礦物質與基質比和組織礦物質密度(TMD)增加，晶體較小但更豐富。
關于Chi/+骨組織的力學特性，這項研究支持以下觀點:受損的礦物-基質相互作用以及受損的膠原和晶體特性是OI中骨脆性增加的原因。從突變Chi/+斑馬魚骨獲得的力學測試數(shù)據與Imbert等人對人骨的研究一致，他們檢測到與使用納米壓痕的生理骨組織相比，受oi影響的骨組織的彈性模量顯著降低，但硬度沒有降低。在健康的骨骼中，較高的礦物質密度預計會導致硬度增加。然而，在OI的情況下，基質的結構和成分受損，礦物質密度的增加并不能彌補與疾病相關的其他骨質量因素的減少。此外，Chi/+(斷裂韌性的替代指標)中較低的彈性模量/硬度比值表明突變體對斷裂的抵抗力較低。
在人類成骨不全癥中，骨基質性質的改變可能與骨重塑率增加、破骨細胞和成骨細胞活性增加有關。雖然有證據表明骨重建確實發(fā)生在硬骨魚中，但評估斑馬魚動態(tài)骨重建的標準化方案尚未建立。在本研究中，靜態(tài)骨組織形態(tài)計量學顯示成骨細胞呈現(xiàn)出特殊的立方體形狀，這與之前關于斑馬魚成骨受損突變體的研究一致。與WT相比，Chi/+中的成骨細胞和類骨指數(shù)略有升高，表明類骨的積累增加。此外，通過2D的組織形態(tài)計量學和3D的x射線顯微鏡可以證明，與WT相比，Chi/+中的骨細胞網絡顯著減少(見圖6)。這可能是在類骨積累后發(fā)生的組織礦化和成熟過程受損的結果，并進一步表明Chi/+中的骨重塑和修復能力受到阻礙。由于OI中成骨細胞礦化類骨的能力受到阻礙，整體骨形成率受到負面影響。雖然Chi/+中骨形成的延遲在幼蟲階段已經被檢測到(圖1)，但尚不清楚這種骨形成缺陷是否導致了在成年魚中觀察到的骨細胞網絡的改變，還是網絡的減少是成骨細胞分化受損或突變體肌肉骨骼活性降低的結果。為了更好地理解導致Chi/+斑馬魚骨質量改變的細胞機制，我們需要進一步研究生理和病理斑馬魚骨細胞網絡。
對斑馬魚突變體的研究有一些局限性。首先，與小鼠骨骼相比，目前只有有限的標準化方案來評估斑馬魚骨骼的結構和骨細胞特性。在斑馬魚骨骼中，不同年齡的骨形成和骨吸收的動力學尚未完全闡明。隨著斑馬魚成為骨骼生物學和疾病研究領域越來越受重視的動物模型，評估該物種的代謝性骨骼特征將變得至關重要。第二，本研究不能提供Chi/+骨的斷裂行為的直接測量。雖然斑馬魚的小尺寸在住房和大規(guī)模人群研究中具有優(yōu)勢，但進行力學測試具有挑戰(zhàn)性。盡管大多數(shù)哺乳動物骨可以在經典的全骨力學測試中進行測試，但對斑馬魚骨力學性能的評估仍然局限于納米壓痕，提供局部力學性能的信息。
綜上所述，本研究為攜帶顯性膠原突變的斑馬魚骨的形態(tài)、結構、成分、力學性能以及組織和細胞指數(shù)提供了定量數(shù)據。多模態(tài)和多尺度的骨骼表征表明Chi/+斑馬魚骨骼中的骨質量顯著受損。骨骼水平的具體表型包括身材矮小、骨畸形和骨折；組織水平的分析反映了較高的骨密度分布，但降低了礦物質和基質成熟度。后一種變化的總和導致了吉娃娃斑馬魚機械性能的降低。與人類OI病例類似，骨脆性增加，在Chi/+突變體中觀察到的畸形和骨折是骨質量改變的結果。吉娃娃斑馬魚可被認為是一種合適的動物模型，反映了人類經典型顯性骨病患者發(fā)生的骨改變。對該模型的深入研究將對改善現(xiàn)有的OI治療策略，特別是新型藥物篩選試驗和給藥，以及包括肌肉骨骼運動在內的常規(guī)治療具有重要價值。
基金：這項研究得到了PIER(No.PIF-2014-28)、德國研究基金會(No.BU 2562/2-1/3-1)、Cariplo基金會(No.2013-0612)、Telethon(No.GGP13098)等的支持。
原文：Fiedler I A K, Schmidt F N, W?lfel E M, et al. Severely impaired bone material quality in chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2018, 33(8): 1489-1499.
原文地址：https://asbmr.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbmr.3445
蘇州木芮生物科技有限公司
Suzhou Murui Biotech Co.，Ltd.
服務熱線：0512-8957 3668
地址：江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)東富路45號聯(lián)創(chuàng)產業(yè)園7幢
手機：18013764755（微信同號）
郵箱：muruibio@sina.com
