雜志：Toxicology
影響因子：4.5（2023）
年份：2023
通訊作者：Dr. Mathieu Vinken
通訊作者單位：Department of Ophthalmology, Tongji Hospital Affiliated with Tongji University School of Medicine, No. 389, Xincun Road, Putuo District,Shanghai 200065, China.Jie Liu
摘要
背景：半胱胺是一種巰基化合物，是活生物體中輔酶a代謝為?；撬岬闹虚g產(chǎn)物。然而，一些研究報道了半胱胺在兒童患者中潛在的不良反應(yīng)，如肝毒性。
方法：為了評估半胱胺對嬰幼兒的影響，以斑馬魚幼體(脊椎動物模型)為研究對象，從72 ~ 144 hpf暴露于0.18、0.36和0.54 mM的半胱胺。檢測細胞一般情況、病理評分、生化指標(biāo)、細胞增殖、脂代謝因子、炎癥因子和Wnt信號通路水平的變化。
結(jié)果：肝臟形態(tài)學(xué)、染色和組織病理學(xué)觀察顯示，半胱胺染毒組大鼠肝臟面積增加，脂質(zhì)沉積，且呈劑量依賴性。實驗半胱胺組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總甘油三酯和總膽固醇水平均高于對照組。與此同時，脂質(zhì)生成相關(guān)因子水平升高，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)因子水平下降。氧化應(yīng)激指標(biāo)如活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶在半胱胺染毒后上調(diào)。隨后，轉(zhuǎn)錄檢測顯示生物素酶和Wnt通路相關(guān)基因在thel暴露組中表達上調(diào)，抑制Wnt信號通路可以部分恢復(fù)異常的肝臟發(fā)育。
結(jié)論：目前的研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸誘導(dǎo)斑馬魚幼魚肝毒性是由炎癥和脂質(zhì)代謝異常引起的，這是由生物素酶(一種潛在的泛氨酸酶同工酶)和Wnt信號介導(dǎo)的。這為半胱胺在兒童中應(yīng)用的安全性提供了一個視角，并確定了預(yù)防不良反應(yīng)的潛在靶點。
關(guān)鍵詞：半胱胺；斑馬魚；肝；泛酸鹽；脂質(zhì)代謝；炎癥。
前言
半胱胺是β-巰基乙胺和2-氨基乙胺的同義物，可以認為是半胱氨酸的脫羧衍生物，實際上是在體內(nèi)由輔酶半胱胺(β-巰基乙胺和2A降解的同義物)產(chǎn)生。酮體、碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的代謝需要輔酶a。輔酶a裂解后產(chǎn)生中間產(chǎn)物泛替氨酸被稱為vanin，由vnn基因編碼)作用于泛汀形成泛酸和半胱胺。
除了胱氨酸耗竭效應(yīng)外，已有研究證明，半胱胺會增加細胞內(nèi)的谷胱甘肽水平，從而恢復(fù)氧化還原狀態(tài)。相反，在高濃度下，半胱胺的氧化會產(chǎn)生過氧化氫分子，引起氧化應(yīng)激。不可避免的是，一些研究報告了半胱胺的副作用。其中，惡心、消化不良、嘔吐、胃脘痛和潰瘍等胃腸道癥狀最為常見，約14%的患者會出現(xiàn)半胱胺不耐受。有鑒于此，半胱胺被廣泛用于胃和十二指腸潰瘍的動物建模。少量半胱胺也被代謝為含硫化合物(二甲基硫化物、甲基硫醇)，這可能導(dǎo)致令人不快的口臭和臭汗 。
以往的研究發(fā)現(xiàn)，半胱胺可引起兒科患者的肝毒性。根據(jù)文獻報道，對一名患有腎病型胱氨酸病和嚴重胃腸運動障礙的2歲女童，每8小時靜脈注射5 mg/kg劑量的鹽酸半胱胺，然后每周增加1 mg/kg。該女孩在給藥后肝轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高，包括堿性磷酸酶升高420IU/1(110-320IU/1為正常年齡)，但感染性肝炎篩查呈陰性。停藥后，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平迅速恢復(fù)正常。半胱胺給藥與肝轉(zhuǎn)氨酶水平升高和正常化之間的巧合表明，肝臟生化指標(biāo)異常是藥物的直接作用。在另一份報告中，半胱胺治療腎病型胱氨酸病可引起肝功能障礙，包括肝靜脈閉塞性疾病。
最近，半胱胺已被評價為治療某些肝臟疾病的一種方法。在一項基于α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AATD)成人和兒童患者的人肝細胞的研究中，半胱胺治療通過挽救α 1-抗胰蛋白酶分泌缺陷和降低氧化應(yīng)激來改善AATD介導(dǎo)的肝毒性。在另一項跨10個臨床中心的多中心隨機臨床試驗中，比較了每日口服酒石酸半胱胺緩釋或安慰劑治療52周后非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)兒童肝臟組織學(xué)的改善情況。結(jié)果顯示，146名兒童參與者中有43名(30%)表現(xiàn)出肝臟組織學(xué)改善。此外，在基線時患有關(guān)鍵1區(qū)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的46名參與者中，12名(28%)最終消退。這里出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果，半胱胺對兒童既有治療作用，也有肝毒性。半胱胺誘導(dǎo)不良反應(yīng)的潛在機制及其與治療效果的平衡值得進一步研究。更重要的是，發(fā)現(xiàn)膳食中補充半胱胺可以調(diào)節(jié)大鼠的內(nèi)分泌和代謝狀態(tài)，增加脂肪組織、腓腸肌和比目魚肌中脂鈣素受體mRNA的表達，這可能涉及到脂鈣素受體在轉(zhuǎn)錄水平上的組織特異性反應(yīng)。聯(lián)合補充共軛亞油酸和半胱胺可增加大鼠肌肉細胞中的脂質(zhì)含量。然而，半胱胺引起肝毒性并影響脂質(zhì)代謝的確切作用機制尚不清楚。
除了與疾病相關(guān)的同源基因高度相似(82%)之外，斑馬魚和人類有相當(dāng)保守的生理過程和器官系統(tǒng)。斑馬魚具有體積小、性成熟周期短、繁殖能力高、胚胎透明、器官發(fā)育快等明顯優(yōu)勢。因此，斑馬魚已成為國際公認的實驗動物，也是研究胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和再生的合適模型。Vanin是泛酸代謝的關(guān)鍵酶，也涉及炎癥和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。此外，已經(jīng)在包括細菌、果蠅、小鼠和人類在內(nèi)的各種原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)了纈氨酸，并且被認為是一種進化上保守的蛋白質(zhì)。然而，在斑馬魚中既沒有發(fā)現(xiàn)過纈氨酸的報道，也沒有從斑馬魚相關(guān)數(shù)據(jù)庫中檢索到纈氨酸基因或蛋白質(zhì)。因此，我們通過生物信息學(xué)分析，尋找潛在的斑馬魚vanin或同源物。
根據(jù)以往的研究，斑馬魚的肝臟在受精后48 h (hpf)開始形成并迅速發(fā)育。在72 hpf時，斑馬魚已經(jīng)具有完整的肝臟形態(tài)和功能。與哺乳動物相比，斑馬魚在暴露于不同的肝毒性藥物時具有相似的基因表達模式。我們曾報道，半胱胺會導(dǎo)致斑馬魚骨骼發(fā)育異常，這一表型與人類和大鼠等哺乳動物的表型一致。因此，半胱胺在模式生物斑馬魚中的適用性得到了澄清，但半胱胺對斑馬魚其他器官和組織的影響仍有待探索。
本研究通過斑馬魚幼魚模型研究了半胱氨酸誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的表型和早期發(fā)育中肝臟脂質(zhì)代謝的紊亂。我們還使用組織切片、免疫熒光染色和實時定量PCR (qRT-PCR)來確定顯著變化。本研究旨在闡明半胱胺引起肝臟脂質(zhì)代謝異常的機制，為半胱胺的合理治療應(yīng)用提供理論背景，從而提高醫(yī)療安全和公眾健康。
半胱胺(CAS No.60-23-1)和IWR-1(CAS No.1127442-82-3)購自Solarbio Technology (Beijing, China)。1-苯基-2硫脲(PTU) (CAS No. 103-85-5)購于德國Sigma-Aldrich公司。蘇木精(CAS No. 517-28-2)-伊紅(CAS No. 15086-94-9)和油紅O (CAS No. 1320-06-5)購于中國上海三工生物科技公司。
斑馬魚飼養(yǎng)
斑馬魚在恒溫(281°C)系統(tǒng)中，在典型的操作設(shè)置下(光照14小時，黑暗10小時)。本研究的斑馬魚轉(zhuǎn)基因系，包括紅色熒光蛋白標(biāo)記的肝細胞Tg(fabp10:DsRed)、綠色熒光蛋白標(biāo)記的中性粒細胞Tg(mpx: GFP)、紅色熒光蛋白標(biāo)記的中性粒細胞Tg(lyz:DsRed)和紅色熒光蛋白標(biāo)記的胸腺T細胞Tg(rag2:DsRed)，均從中國斑馬魚資源中心(中國武漢)獲得。培育雙轉(zhuǎn)基因菌株Tg(fabp10:DsRed;mpx:GFP)，將Tg(fabp10:DsRed)和Tg(mpx:GFP)的雌性或雄性轉(zhuǎn)基因菌株放入交配池中。次日上午，收集受精卵，置于培養(yǎng)液(鹽度0.5%，CaCO3: 150 mg/L, pH: 7.0，電導(dǎo)率:500μS/cm)中保存。所有動物研究均按照《實驗動物福利指南》進行中華民國科學(xué)技術(shù)部(2006)并隨經(jīng)井岡山大學(xué)動物研究所批準(zhǔn)，所有動物實驗均在雅高進行與人民的實驗動物福利準(zhǔn)則共舞中華民國科學(xué)技術(shù)部(2006)并隨經(jīng)井岡山大學(xué)機構(gòu)動物保護與使用委員會批準(zhǔn)。
藥物治療
半胱胺與培養(yǎng)基在室溫下溶解，原液濃度為20 g/L, 4℃保存。實驗中，用斑馬魚培養(yǎng)基稀釋半胱胺儲存液，達到合適的濃度。胚胎培養(yǎng)液中添加0.003% PTU，抑制皮膚色素沉著生長。在顯微鏡下，選擇發(fā)育形態(tài)正常的斑馬魚進行研究，在72 hpf(每孔30只幼魚)的條件下置于6孔板中。根據(jù)我們之前的研究(Chen et al.， 2022)，實驗分為空白對照組(僅培養(yǎng)基)、低濃度(L)組(0.18 mM)、中濃度(M)組(0.36 mM)和高濃度(H)組(0.54 mM)。每組重復(fù)3次，幼魚在28.5℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育3天。每天更換新鮮溶液。此外，為了研究半胱胺對斑馬魚免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響，在0 hpf至72 hpf的幼體斑馬魚身上重復(fù)上述實驗，除處理時間外保持程序一致。RNA序列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
斑馬魚形態(tài)改變
用100 mg/L三卡因麻醉斑馬魚幼魚，暴露72 h后固定在3%甲基纖維素中，使用立體熒光顯微鏡(Zeiss, AXIO ZoOM)捕捉并記錄各組肝臟側(cè)熒光的面積和強度。V16,德國)。免疫細胞的熒光圖像采集也沿用了上述方法。在72 hpf下觀察中性粒細胞，而在144 hpf下觀察胸腺T細胞。
斑馬魚油紅O染色
半胱胺處理72 h后，每組隨機取15只幼魚，用過量麻醉劑安樂死。用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛(PFA)浸泡過夜，以25%、50%、75%和100%甲醇(PBST配制)梯度脫水，0.5%油紅O室溫染色24 h，再水合至100% PBS。用甲基纖維素固定后，在雙筒顯微鏡(德國徠卡M205 FA)下檢查并拍照。
斑馬魚肝臟的組織病理學(xué)
從每組中隨機抽取10只安樂死的幼魚，固定在4% PFA中，然后在乙醇梯度中脫水并浸泡在二甲苯中。石蠟包埋的斑馬魚標(biāo)本用徠卡RM2235德國顯微鏡進行切片，HE染色。在德國徠卡DM6B顯微鏡下對組織切片進行觀察和測量。
斑馬魚蘇丹黑和中性紅染色
蘇丹黑特別使中性粒細胞變黑。給藥3 d后，每組隨機選取10只安樂死幼魚，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，用1 xPBS洗滌2次，每次5 min。用4% PFA在4°C下固定過夜后，每個離心管中加入1 ml 0.3%蘇丹黑染色液，在搖床上染色40分鐘。用75%乙醇沖洗掉多余的染料。用甲基纖維素固定幼魚，體視顯微鏡(Leica M205 FA，德國)下拍攝側(cè)尾圖像。
中性紅特異性地將巨噬細胞染成紅色。給藥3 d后，每組隨機選取10只幼魚，用含0.5%中性紅的培養(yǎng)液5 ml染色持續(xù)5小時，用培養(yǎng)基沖洗掉多余的染料。將幼魚麻醉并用甲基纖維素固定后，在徠卡體視顯微鏡下拍攝背頭圖像。
斑馬魚肝臟生化參數(shù)的測定
每組取60只安樂死幼魚用0.9%生理鹽水勻漿。樣品在2500 rpm下離心10 min后，收集上清進行分析。根據(jù)制造商的說明書(南京醫(yī)院(中國南京生物工程研究所)測量和評估丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、高密度脂蛋白(HDL)、總甘油三酯(TC)和總膽固醇(TG)酶活性。
免疫熒光成像
在144hpf下安樂死的斑馬魚用4% PFA在4°C下保存過夜，用1倍PBS洗滌三次，每次5分鐘。第二天在20°C下進行丙酮處理4小時。之后，斑馬魚幼魚剝皮，用3% PT (3% Triton x -100加入1倍PBS)洗滌3次，每次5分鐘。將斑馬魚幼魚與PBTN (3% PT中添加4% BSA和0.02% NaN3)在室溫下孵育1小時，然后用小鼠抗pcna抗體(1:100,ab71286, Abcam, UK)在4℃下孵育過夜。一抗用綠色熒光抗小鼠抗體標(biāo)記，該抗體購自InvitrogenTM (Carlsbad, USA)。接下來，將樣品用新配制的DAPI (Roche，德國)溶液(2 ug/ml)在PBS中染色1小時。最后，使用共聚焦激光顯微鏡(Leica TCS SP8，德國)進行熒光成像。
氧化應(yīng)激檢測
氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平在本研究中使用特定的試劑盒進行測量。首先，在暴露于半胱胺72 hpf后，每組80只斑馬魚胚胎在低溫下麻醉，然后進行3次5分鐘的PBS洗滌。然后將其與生理鹽水混合。在4℃下，10000 g離心10分鐘后的上清液用于測量酶的活性。采用BCA法，計算各組總蛋白含量。為了測量吸光度，使用SpectraMax iD3多功能微孔板檢測器。通過與硫代巴比妥酸反應(yīng)在532 nm處測定MDA，通過抑制亞硝酸鹽形成在550 nm處測定SOD。同時測定了sod1和sod2的相對mRNA水平。采用以下方法檢測活性氧(ROS)。將半胱胺處理至72 hpf的斑馬魚胚胎置于含有10 mg/ml二氯二氫熒光素二乙酸酯(DFCH-DA)的培養(yǎng)基中，室溫下處理30 min，避免光照。沖洗和麻醉后，用體視顯微鏡(德國徠卡)拍攝ROS的分布。所有程序均在制造商(中國南京建成生物工程研究所)的建議下進行。實驗重復(fù)3次。
基因表達的定量逆轉(zhuǎn)錄- pcr分析
采用Tranzol UP (ET111-01, Takara, Japan)提取每組20只幼魚的總RNA。利用cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(AE311-03, TRANS，中國)，將1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。TransStart Green qPCR Supermix (AQ601-02, TRANS，中國)使用ABI Step One Plus RTPCR機(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)運行qRT-PCR。反應(yīng)在以下條件下進行了40個循環(huán):95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性30秒，60℃退火30秒。采用內(nèi)參基因eflo對實驗誤差進行校正。表S1列出了本研究使用的引物序列。
救援實驗
每組隨機選取發(fā)育良好的72hpf胚胎20個，放置于6孔板中，空白對照組只添加培養(yǎng)基，陽性對照組添加0.54 mM半胱胺，實驗組添加0.54 mM半胱胺和0.5 μM IWR-1(一種Wnt信號通路抑制劑)。采用蔡司立體熒光顯微鏡(ZOOM.V16)對144hpf下的斑馬魚肝臟和中性粒細胞進行觀察和拍照。
生物信息學(xué)分析
人類和小鼠VNN1蛋白序列從Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲得，tBlastn在線在Ensembl網(wǎng)站上進行。Uniprot Blast在線比對蛋白一級序列。系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用MEGA-X鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)。
聚類分析
采用數(shù)據(jù)聚類的可視化統(tǒng)計方法，測定半胱胺對斑馬魚脂質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)的影響。指標(biāo)包括斑馬魚的形態(tài)參數(shù)、肝酶活性、免疫細胞計數(shù)和相關(guān)基因的相對表達水平。將數(shù)據(jù)歸一化以計算z分數(shù)(暴露組的平均值減去對照組的平均值除以對照組的標(biāo)準(zhǔn)差)。使用TBtools軟件對這些數(shù)據(jù)進行聚類和分析(Chen et al.， 2020)。
統(tǒng)計分析
兩位不同的研究人員對數(shù)據(jù)和圖像進行了盲檢。使用ImageJ軟件進行圖像統(tǒng)計。在亮場圖像中計算卵黃囊和油紅O染色面積，以及染色的免疫細胞數(shù)量;熒光圖像計算斑馬魚肝臟面積、免疫細胞數(shù)量和PCNA抗體標(biāo)記的增殖細胞數(shù)量。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D)表示，采用單因素方差分析(one - way ANOVA)確定顯著差異。如未另行說明，與空白對照比較，統(tǒng)計學(xué)顯著性定義為*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
結(jié)果
為了確定半胱胺的生物毒性，斑馬魚胚胎暴露于規(guī)定濃度的半胱胺。然后對斑馬魚進行形態(tài)學(xué)檢查。從72hpf到144 hpf，暴露于0.18、0.36和0.54 mM的半胱胺中，斑馬魚的體長縮短(圖1A, C)，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(圖1D)隨著暴露濃度的增加而增加。斑馬魚胚胎發(fā)育受到不同影響。這些表型觀察表明，半胱胺暴露導(dǎo)致斑馬魚的發(fā)育毒性。在Tg(fabp10:DsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚中觀察到肝損害(圖1B)，肝臟發(fā)育正常，但半胱胺導(dǎo)致肝臟腫脹，肝邊緣不清，藥物治療后肝臟總面積顯著增加(圖1E)。肝臟熒光強度無明顯變化(圖1F)。Tg (fabp10:安全域;mpx:GFP)雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚在半胱胺處理組中肝臟出現(xiàn)中性粒細胞聚集，表明肝臟出現(xiàn)炎癥反應(yīng)(圖1G,H)。
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圖1 不同濃度的半胱胺在144 hpf下誘導(dǎo)的肝臟發(fā)育異常和免疫細胞募集。(A)斑馬魚幼體形態(tài)。(B) Tg (fabp10: DsRed)斑馬魚的laval肝面積。幼魚(C)體長、(D) BMI、(E)肝臟面積、(F)熒光強度定量分析。(G)轉(zhuǎn)基因菌株Tg肝臟區(qū)域代表性圖像(fabp10:DsRed;mpx: GFP)。(H)中性粒細胞數(shù)量定量分析。比例尺:200 um (A)， 100 um (B, G). *P< 0.05, P< 0.01, P< 0.001，平均值±S.D.
半胱胺誘導(dǎo)斑馬魚肝臟的組織學(xué)和病理學(xué)改變
卵黃的大小可以用來評估斑馬魚幼魚肝臟的代謝功能，因為在沒有外部能量供應(yīng)的情況下，卵黃是用來維持發(fā)育和運動的。結(jié)果顯示，半胱胺以劑量依賴的方式延遲了蛋黃的攝取(圖2A;B)。在144 hpf時，0.54 mM半胱胺處理組的蛋黃面積顯著大于對照組，說明肝臟存在顯著代謝紊亂。正常肝臟無脂質(zhì)沉積，油紅O不染色;少量脂質(zhì)沉積或僅部分肝臟有脂質(zhì)沉積，則油紅O染色較輕或僅部分肝臟染色;肝臟出現(xiàn)嚴重的脂質(zhì)沉積，整個肝臟被非常深的油紅o染成紅色。處理組斑馬魚肝臟出現(xiàn)嚴重的脂質(zhì)沉積(圖2 A, C)。對照組斑馬魚肝臟組織學(xué)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，細胞完整飽滿，經(jīng)0.54 mM半胱胺處理后肝細胞變形不規(guī)則。此外，細胞間接觸變得松散，細胞間基質(zhì)減少，形成空泡(圖2D)。
圖2 暴露于144 hpf不同濃度半胱胺的肝臟脂質(zhì)積累和組織學(xué)異常。(A)全載斑馬魚的油紅o染色圖像。幼魚(B)卵黃區(qū)和(C)油紅o染色區(qū)定量分析(D)斑馬魚幼魚肝臟HE染色，左下角黃框內(nèi)的放大圖像。比例尺:100 um (A, C)， 200 um (B). *P<0.05, P<0.01, wP<0.001，平均值±S.D.
半胱胺改變了斑馬魚的肝臟生化參數(shù)
采用增殖細胞核抗原抗體和原位末端標(biāo)記法檢測半胱胺肝毒性是否與幼魚肝細胞增殖有關(guān)。結(jié)果顯示，經(jīng)0.54 mmol/L半胱胺處理后，肝細胞的增殖能力降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3a)G).測定72 hpf下全魚勻漿中ALT、AST、HDL、TG和TC的含量。除HDL外，所有指標(biāo)均呈劑量依賴性增加(圖3 B-F)。與對照組相比，0.36 mM半胱胺處理組TG和TC略有變化，其他指標(biāo)均顯著升高。在0.54 mM半胱胺處理組，所有指標(biāo)均顯著升高。HDL在L組升高，H組降低，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果說明，半胱胺誘導(dǎo)斑馬魚肝腫大的主要原因是脂質(zhì)蓄積，而非肝細胞增殖。
圖3 在144 hpf下暴露于不同濃度半胱胺的免疫熒光圖像和肝臟生化參數(shù)。(A)綠色熒光顯示的肝細胞增殖(PCNA蛋白)圖像。(B) ALT， (C) AST， (D) HDH， (E) TG， (F) TG， (G) PCNA陽性細胞數(shù)。每分鐘酒吧規(guī)模:200嗯(A) < 0.05, * * P < 0.001, P < 0.01,平均值±S.D.
半胱胺擾亂了斑馬魚的先天和獲得性免疫系統(tǒng)
利用在中性粒細胞中表達紅色熒光蛋白的斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(lyz:DsRed)檢測半胱胺對斑馬魚固有免疫系統(tǒng)的毒性作用。鑒于幼魚中性粒細胞主要存在于尾端造血組織(CHT)中，本研究重點關(guān)注該組織內(nèi)的變化。結(jié)果顯示，在72 hpf的半胱胺暴露后，處理組斑馬魚尾部中性粒細胞數(shù)量增加(圖4a)。作為對這些觀察結(jié)果的進一步證實，暴露于半胱胺的幼魚尾部中性粒細胞用蘇丹黑B染色，得到了類似的結(jié)果(圖4a)，這意味著半胱胺暴露顯著增加了斑馬魚幼魚的中性粒細胞計數(shù)(圖4a)，F(xiàn))。獲得了中性粒細胞紅色染色的胚胎中巨噬細胞的背側(cè)圖像，隨著半胱胺暴露的增加，巨噬細胞數(shù)量逐漸減少(圖4 C, G)。利用具有熒光胸腺t細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚菌株Tg (Rag2:DsRed)研究了半胱胺對幼魚獲得性免疫系統(tǒng)的毒性。隨著半胱胺濃度的增加，在144 hpf時觀察到斑馬魚胸腺體積的減少(圖4 D, H)?？傊腚装穼Π唏R魚幼魚具有免疫毒性作用，并且毒性隨著半胱胺濃度的增加而增強。
圖4 暴露于不同濃度半胱胺的幼體斑馬魚的免疫細胞變化。(A)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(TelyzDsRed)和(B)全載蘇丹黑黑染色的造血尾端組織中72 hpf的中性粒細胞數(shù)量。(C)中性紅染色后背頭72 hpf時的巨噬細胞計數(shù)。(D) Tg (Rag2:DsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚144 hpf時胸腺體積。(E) tgclr:DsRed轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚中性粒細胞數(shù)量，(F)蘇丹黑染色全載中性粒細胞數(shù)量，(G)中性紅染色巨噬細胞計數(shù)，(H)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胸腺體積Te (Rog2-DsRed)。比例尺:200um (A-C)， 100um (D)，P< 0.05,P< 0.01,P< 0.001，平均值±S.D.
半胱胺過度激活氧化應(yīng)激過程
通過ROS分布、SOD活性、MDA含量等指標(biāo)檢測半胱胺誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚肝毒性和免疫毒性中的氧化應(yīng)激狀態(tài)。與對照組相比，半胱胺處理組的ROS熒光強度顯著增強(圖5A, B)。半胱胺暴露導(dǎo)致sod1和sod2在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(圖5 C, D)。與對照組相比，SOD活性和MDA含量分別在0.36 mM和0.54 mM顯著降低和升高(圖5 E, F)。結(jié)果表明，半胱胺暴露導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平顯著升高。
圖5 暴露于半胱胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。(A) ROS染色。(B) ROs熒光強度。(C) sod1相對mRNA水平。(D)相對mRNAsod2水平。(E) MDA含量。(F) SOD活性。比例尺:100 um (A). p< 0.05,p<0.01, p<0.001，平均值±S.D.
生物信息學(xué)分析
為了鑒定斑馬魚vnnl同源基因，我們使用Ensemble在線blast工具，以人類Vanin1蛋白作為參考序列，對斑馬魚基因組(GRCz11)進行比較。發(fā)現(xiàn)斑馬魚vnnl同源基因為雙截獲生物素酶(btd)，位于第19染色體上，位置信息為Chr 19:2002964-2004133和Chr 19:2001516-2001674。斑馬魚的btd基因含有3個外顯子，編碼520個氨基酸的蛋白。斑馬魚生物素酶蛋白與人類Vaninl和小鼠Vaninl蛋白具有高度的序列同源性(圖S1 a)。此外，我們使用Mega的NJ分析構(gòu)建了迄今為止克隆的幾個物種的Vaninl氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。斑馬魚的生物素酶與非洲爪蛙和果蠅的vnn1同源物相似，而與另一種骨魚密西西比白鱘(Mississippi paddlefish)的距離較遠，這可能表明它們在進化上并不相同(圖s1b)。
半胱胺引起免疫信號和脂質(zhì)代謝基因表達異常
從上述實驗可以看出，半胱胺暴露在斑馬魚體內(nèi)引起肝毒性和免疫毒性。采用qRT-PCR技術(shù)測量了半胱胺暴露對144hpf斑馬魚基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與免疫信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵基因出現(xiàn)上調(diào)。與對照組相比，治療組的cxcl-clc、il-8和ifn-y的表達水平更高。特別是，與對照組相比，0.54 mM組il-8和ifn-y的表達增加了四倍以上。雖然tlr4在所有濃度藥物治療組中均有所增加，但低劑量組和中劑量組均未顯示出顯著差異(圖6 a - d)。此外，72hpf時炎癥因子轉(zhuǎn)錄物表達水平的總體趨勢與144hpf時相關(guān)。半胱胺暴露導(dǎo)致斑馬魚在72hpf時炎癥因子表達上調(diào)(圖6 E-H)。
此外，半胱胺暴露也影響了斑馬魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達。在144 hpf下，暴露于0.36和0.36的幼魚體內(nèi)，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 (srebf1)、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2 (srebf2)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶A (hmgcra)和脂肪酸合成酶(fasn)的轉(zhuǎn)錄物水平顯著升高0.54 mM半胱胺與對照相比，而三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白1a (abcala)和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白1b (abcalb)顯著下調(diào)(圖6 I-N)。三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白la (abcala)和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白1b (abcalb)的表達水平顯著下調(diào)(圖6 E-J)。這些基因參與脂肪形成、脂肪積累和膽固醇代謝。生物素酶(btd)表達增加，過氧化物酶體增殖物激活受體y (ppary)表達降低(圖6 O-P)。
圖6 暴露于不同濃度鉻胺的斑馬魚幼魚相對mRNA水平。(A-D) 144 hpf時炎癥因子:ifn-y。tlr4。Il-8和cxcl-clc。(E-H) 72 hpf時的炎癥因子:ifn-y、tir4、il-8和cxcl-clc。(I-N) 144 hpf時脂質(zhì)代謝因子:srebfl、srebf2、hmgcra和fasn。(O-P)144 hpr時泛酸代謝因子:p0.05, P0.01,P<0.001，平均值S.D.
Wnt信號參與半胱氨酸誘導(dǎo)的肝臟和免疫發(fā)育缺陷
為了探究半胱胺是否影響Wnt信號傳導(dǎo)，我們首先評估了Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。半胱胺暴露后，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點axin2和lef1以及Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵基因ctnnbl通過定量聚合酶鏈反應(yīng)出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖7 H-J)，表明半胱胺激活了Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。下一步，我們在斑馬魚胚胎中通過IWR-1抑制Wnt信號。IWR-1顯著緩解了半胱胺引起的肝臟和免疫發(fā)育缺陷(圖7 A-E)，上調(diào)了ppar-y的表達，但沒有顯著改變btd的表達(圖7 F, G)。
圖7 Wnt信號在眼胺誘導(dǎo)的肝臟發(fā)育不良中的作用。(A)在144 hpf下，0.2 pM TWR-暴露于0.54和0.54 mM半胱胺的斑馬魚幼魚的亮場圖像。(B)在144 hpf下暴露于0.54和0.54 mM半胱胺和0.2微米IWR-1的Te (fabp10: DsRed)斑馬魚的左肝面積。(C)在144 hpf下，暴露于0.54和0.54 mM半胱胺和0.2 μ m IWR-1條件下的Telyz:DsRed斑馬魚造血尾端組織中中性粒細胞數(shù)量。定量分析(D) Tg(fabp10: DsRed)斑馬魚的肝臟面積和(E) Tg(lyz:DsRed)斑馬魚的中性粒細胞數(shù)量。顯微鏡下成像的斑馬魚暴露于Tg(twhh: GFP)幼魚1.05 mM evsteamine和1.05 mM evsteamine與60微米丙戊酸鈉在72 hpf下。(F-G)暴露于0.54和0.54的斑馬魚的相對pparty和btd mRNA水平0.54 mM半胱胺，在144 hpf下0.2 uM IWR-1。(H-J)暴露于不同濃度半胱胺的斑馬魚幼魚Wnt信號mRNA的相對水平。比例尺:200 um (A)， 100 um (B-C)，P<0.05,P<0.01， *P<0.001，平均值±S.D.
聚類分析
通過分層聚類分析對斑馬魚肝臟和免疫系統(tǒng)指標(biāo)及相關(guān)基因表達進行歸一化和分類后，得到了一個清晰的、有區(qū)別的排序(圖8)?？梢暬Y(jié)果形象地概括了半胱胺暴露在斑馬魚中引起的顯著差異。具體來說，與對照組相比，TC、油紅o染色區(qū)域以及fasn、ifny和cxcl-clc的表達水平顯著升高。
圖8 分層聚類分析揭示了半胱胺暴露對斑馬魚脂質(zhì)代謝、免疫系統(tǒng)和相關(guān)基因表達的影響。
我們進一步分析了在四個簇中表達的頂級標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達在其中一個簇中，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)。功能富集分析顯示，上述4個細胞簇中表達的很多基因具有毛細胞相關(guān)的生物學(xué)功能(圖3C-F)，這表明這些細胞是毛細胞。為了進一步確認毛細胞的聚類和注釋，我們進行了全載原位雜交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛細胞中表達，根據(jù)我們的分析，嵴毛細胞被認為位于簇12(圖3H)，這與之前的研究[21]一致。至于簇0和7的細胞，雖然都是神經(jīng)肥大毛細胞，但它們之間存在差異。根據(jù)成熟和年輕毛細胞標(biāo)志物s100s[22]和prox1a[23]在兩個簇中的表達情況，簇0的細胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細胞，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細胞(圖S4)。
另一方面，我們分析了支持細胞的標(biāo)記基因klf17[24]，發(fā)現(xiàn)它主要表達在簇1的細胞中(圖S5)，這表明這一簇細胞是支持細胞。同樣，我們還分析了據(jù)報道在套細胞中表達的基因，如tnfsf10、ponzr6、pkhd1l1、fat1b、crb3b、cts12、ovgp1和cldne[17]，發(fā)現(xiàn)高水平表達這些基因的細胞聚集在簇9中(圖S6)。然而，它們表達了一些已被證明在毛細胞中特異性表達的基因，如myo6b[25]、myo7aa[26](圖S7)，這提出了它們是可以分化為毛細胞的支持細胞的可能性。因此，我們得出結(jié)論，來自簇1和9的細胞分別是支持細胞和套細胞，來自簇14的細胞可能是毛細胞祖細胞。
討論
半胱胺與半胱胺二硫的氧化還原反應(yīng)是半胱胺雙相效應(yīng)的基礎(chǔ)。通過使用低濃度的半胱胺，半胱氨酸被轉(zhuǎn)運到細胞中，在細胞中進一步轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽。谷胱甘肽的抗氧化特性在調(diào)節(jié)細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。盡管如此，高濃度的半胱胺與過渡金屬結(jié)合會產(chǎn)生過氧化氫分子，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。因此，劑量選擇很重要，以避免半胱胺治療各種疾病的任何并發(fā)癥。人類血液中的半胱胺水平通常低于檢測閾值(<0.1 μM)。重酒石酸半胱胺在15mg /kg時產(chǎn)生的峰值血漿濃度為給藥1小時后0.03-0.07 mM 。其他研究報道了與高劑量半胱胺治療相關(guān)的罕見副作用(>90 mg/kg/day (1.95 g/m2/day))，包括骨痛、肌痛和肘部瘀傷(皮膚活檢中反應(yīng)性血管內(nèi)皮質(zhì)骨質(zhì)疏松)。回顧性隊列研究130例患者接受0.55%(約48 mM)鹽酸半胱胺滴眼液治療45個月后，報告了47個非嚴重不良反應(yīng)(一般為一過性刺激、刺痛、或視物模糊)和4起嚴重不良事件(包括角膜炎和角膜潰瘍)。本研究中半胱胺的暴露濃度比人類治療性暴露低幾個數(shù)量級，0.18 mM及以上的半胱胺劑量會導(dǎo)致斑馬魚幼魚的肝毒性，其特征是炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常。雖然現(xiàn)有的證據(jù)并不能證實半胱胺暴露的相對劑量強度，由于之前沒有半胱胺與斑馬魚肝臟的相關(guān)報道，但基于以上事實，我們認為至少本實驗中使用的0.54 mM是斑馬魚的高暴露劑量。仍有必要探索與斑馬魚試驗中使用的濃度有關(guān)的人類相關(guān)性。
在本研究中，我們培養(yǎng)了熒光蛋白標(biāo)記的肝細胞和炎癥細胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，以便在體內(nèi)直接觀察肝損傷和炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，在發(fā)育早期暴露于半胱胺會導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟異常增大，肝中性粒細胞增加，肝臟脂肪沉積，轉(zhuǎn)氨酶增加，脂質(zhì)代謝因子和炎癥因子破壞，表現(xiàn)出與人類相似的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)樣病變。
脂肪沉積在肝臟和飽和游離脂肪酸的積累是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的標(biāo)志。肝細胞受到這些脂肪沉積的毒性影響，導(dǎo)致疾病進展。由于脂肪毒性，肝臟可能受損并引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎和纖維化。然而，在目前的研究中，在肝臟發(fā)育開始之前的半胱胺暴露導(dǎo)致免疫系統(tǒng)改變，其特征是中性粒細胞增多和72 hpf時斑馬魚炎癥因子表達升高。炎癥反應(yīng)也可能影響發(fā)育中的肝臟脂質(zhì)代謝過程，兩者可能在NAFLD中相互促進。僅就本研究而言，炎癥似乎是肝臟脂質(zhì)代謝異常的起始因素，需要進一步的實驗來闡明兩者之間的關(guān)系。
大多數(shù)生理過程和疾病都涉及氧化應(yīng)激。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)半胱胺的劑量依賴性分布會增加斑馬魚體內(nèi)的活性氧種類。半胱胺處理后氧化產(chǎn)物MDA含量的增加與這些結(jié)果一致。至于轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上SOD的降低，可能是氧化應(yīng)激過度激活后的代償性變化。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，半胱胺暴露后，氧化應(yīng)激的上調(diào)是斑馬魚的一個顯著病理特征。
有趣的是，半胱胺曾被用作抗氧化劑用于治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一項多中心、安慰劑對照、雙盲試驗中，包括169名活檢證實為NASH的兒童(8-17歲)，盡管ALT和肝葉炎癥有顯著改善，但未能達到主要結(jié)局指標(biāo)(NAFLD活動評分降低2分或更多，肝纖維化未惡化)。與上述研究結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)半胱胺反而導(dǎo)致總甘油三酯和總膽固醇升高、肝脂肪變性，并顯著增加srebfl、srebf2、hmgra和fasn(參與脂肪形成和脂質(zhì)積累的基因)的轉(zhuǎn)錄水平，而abcala和abcalb(與膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因)的表達水平在早期發(fā)育的幼魚中顯著下調(diào)，表現(xiàn)出非酒精性脂肪肝樣病變。這與前面提到的半胱胺的雙相作用有關(guān)，但也提示除了抗氧化劑之外，半胱胺還有其他靶點的可能性。
Vanin是輔酶a向半胱胺代謝的關(guān)鍵酶循環(huán)，也參與炎癥和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。出乎意料的是，我們沒有在NCBI、ZFIN、UNIPROT和ENSEMBL等數(shù)據(jù)庫中檢索到斑馬魚pantetheinase或vanin (vnn)對應(yīng)的基因或蛋白質(zhì)的存在。通過與斑馬魚蛋白數(shù)據(jù)庫的比對，我們鑒定出了生物酶前體(pre-btd)，它們與釩蛋白屬于同一水解酶超家族。在人類中，這兩種蛋白質(zhì)都分解線性酰胺中的碳氮鍵，而不是肽鍵。據(jù)推測，斑馬魚btd在泛茶氨酸的分解代謝中起著類似于纈氨酸的酶的作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)半胱胺暴露導(dǎo)致斑馬魚幼魚btd mRNA水平上調(diào)。
vnnl基因在肝臟、腎臟和內(nèi)分泌腺等代謝活性較高的組織中高度表達。從分子上看，vanin在肝臟的脂質(zhì)代謝和?；撬岷铣芍衅鹬匾饔?。此外，在炎癥性銀屑病皮膚的免疫組化中觀察到，觸發(fā)氧化應(yīng)激或炎癥應(yīng)激的藥物可促進vnn3的表達。與野生型(WT)小鼠相比，vnn1基因敲除小鼠對氧化應(yīng)激暴露的抵抗力更強。這種抗性可以通過給藥半胺(半胱胺的氧化形式)來消除，可能是由于抑制了通過蛋白質(zhì)二硫鍵交換合成谷胱甘肽所需的y-谷氨酰半胱氨酸合成酶。有人認為，vnnl可能會促進炎癥。另一項研究發(fā)現(xiàn)，vnn1(-/-)小鼠對急性(NSAID給藥)和慢性(血吸蟲感染)誘導(dǎo)治療均產(chǎn)生較低的炎癥反應(yīng)。因此，vnnl對于先天免疫細胞感知壓力的能力至關(guān)重要。另一方面，肝細胞表達vaninl蛋白，尤其是靠近中央靜脈的區(qū)域性小葉中心肝細胞。幾種NAFLD小鼠模型顯示Vnn1 mRNA表達升高。脂質(zhì)代謝可能直接受到泛酸酶活性的影響。正如其他研究表明的那樣，vnn1在肝細胞脂質(zhì)之前上調(diào)在小鼠和人肝癌Huh-7細胞中均有vnn1的聚集，提示vnn1的激活可能是疾病的始動因素。
這些結(jié)果表明vnn與脂質(zhì)代謝和炎癥密切相關(guān)。而半胱胺又是如何影響btd (vnn的替代物)的表達，進而導(dǎo)致炎癥上調(diào)和脂質(zhì)代謝紊亂的呢?從現(xiàn)有的結(jié)果來看，我們假設(shè)，由于輔酶a -泛酸-半胱胺是一種循環(huán)代謝狀態(tài)，外源性半胱胺導(dǎo)致輔酶a合成增加，進而誘導(dǎo)泛酸增加和btd表達水平升高，并導(dǎo)致下游分子的一系列改變，包括促炎因子增強以及肝臟脂肪生成過度活躍。
此外，過氧化物酶體增殖體激活受體y (ppary)和傳統(tǒng)的Wnt/ b -連環(huán)蛋白軸經(jīng)常相互對立;一個增加，另一個被抑制，反之亦然。這兩種成分之間的相互作用似乎在炎癥、氧化應(yīng)激和癌癥中非常常見。也證實了纈氨酸對腸上皮細胞中pparty mRNA表達的直接影響。特別是，PPARy可以抑制由活性蛋白1(AP1)、κ B核因子(NF-xB)和轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子1(STAT1)介導(dǎo)的脂多糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。至于Wnt信號傳導(dǎo)與vanin之間的關(guān)系，目前尚未見文獻報道。在本研究中，Wnt信號抑制劑IWR-1對btd的表達沒有顯著影響。上述結(jié)果初步提示，半胱胺可引起btd上調(diào)。隨后，它誘導(dǎo)pany下調(diào)，然后通過激活Wnt信號通路引起肝臟炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂。
結(jié)論
綜上所述，本研究表明，半胱胺可誘導(dǎo)斑馬魚幼魚的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致肝臟損傷。并且首次發(fā)現(xiàn)，這些病理變化可能是由btd(一種分子起始事件)共同介導(dǎo)的，btd可能在斑馬魚體內(nèi)充當(dāng)vanin同工酶，與半胱胺在泛酸降解過程中產(chǎn)生相互反饋調(diào)節(jié)。進一步說，氧化應(yīng)激的激活和Wnt信號的上調(diào)可能也參與了這一過程。兒童服用半胱胺時，應(yīng)合理控制劑量，警惕其潛在的炎癥反應(yīng)和肝毒性。
基金：中國科學(xué)技術(shù)部(2021 VEA1101300和2020YFA0112500);國家自然科學(xué)基金中國(82070920)。
本文章原文：https://doi.org/10.1016/j.tox.2023.153555
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