前言
皮膚病是嚴(yán)重影響人民健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，如麻風(fēng)、疥瘡、真菌病、皮膚細(xì)菌感染等。且皮膚病的發(fā)病率很高，疾病類型從腫瘤到炎癥，其后果可能嚴(yán)重到死亡和毀容。盡管體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型已經(jīng)對(duì)皮膚病的發(fā)病機(jī)制和治療方法的發(fā)展產(chǎn)生了重要的見(jiàn)解，但我們對(duì)這些疾病的理解仍然存在重大差距。
目前，將斑馬魚(yú)模型用于人類皮膚疾病的研究已經(jīng)產(chǎn)生了令人鼓舞的結(jié)果，新的遺傳工具的進(jìn)化將增加可用模型的數(shù)量和質(zhì)量，為人類皮膚病建模和開(kāi)發(fā)未來(lái)的治療方法提供了更大的機(jī)會(huì)。斑馬魚(yú)皮膚與人類皮膚的相似之處表明該模式生物特別適合研究腫瘤性和炎癥性皮膚病，且斑馬魚(yú)良好的生物學(xué)特性使其非常適合活體高通量藥物篩選。在過(guò)去的20年里，斑馬魚(yú)也越來(lái)越多地被用于模擬非腫瘤性皮膚病，如牛皮癬、白癜風(fēng)、表皮大皰和慢性損傷等（表1）。接下來(lái)，本文將從斑馬魚(yú)皮膚的具體特征，以及斑馬魚(yú)模型在部分皮膚病研究中的應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行介紹。
表1 斑馬魚(yú)類疾病模型中人類皮膚病的主要模型
斑馬魚(yú)的皮膚特征
在過(guò)去的二十年里，斑馬魚(yú)已經(jīng)成為研究人類皮膚病的重要模式生物。斑馬魚(yú)具有高度同源的皮膚結(jié)構(gòu)。與哺乳動(dòng)物相似，斑馬魚(yú)的皮膚組織為兩層：由多層角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）組成的表皮，以及含有混合成纖維細(xì)胞、KCs、色素細(xì)胞和免疫細(xì)胞的真皮層。這些結(jié)構(gòu)發(fā)育迅速，KCs最早在受精后1天出現(xiàn)，在受精后第6天形成表皮/真皮邊界。大約在受精后25天，表達(dá)p63-的基底斑馬魚(yú)干細(xì)胞開(kāi)始增殖，形成一層新的基底上瞬時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞。與人類皮膚類似，斑馬魚(yú)表皮干細(xì)胞的一個(gè)亞群在表皮增厚過(guò)程中參與不對(duì)稱增殖并改變形狀。在成年斑馬魚(yú)中，這種多層層狀鱗狀上皮被基底膜區(qū)與真皮分離。斑馬魚(yú)的黑素細(xì)胞與哺乳動(dòng)物類似，是神經(jīng)嵴來(lái)源的細(xì)胞，負(fù)責(zé)色素的產(chǎn)生。在成年斑馬魚(yú)中，黑色素細(xì)胞可以在兩個(gè)位置發(fā)現(xiàn)：在鱗片頂部的表皮層和在皮下發(fā)現(xiàn)的高度組織化的條紋。
斑馬魚(yú)在皮膚結(jié)構(gòu)上還有其他一些不同之處。作為水生動(dòng)物，斑馬魚(yú)不需要哺乳動(dòng)物角質(zhì)層的不透水屏障功能。斑馬魚(yú)也沒(méi)有毛囊，但是，斑馬魚(yú)身上覆蓋著一排排重疊的鱗片，每個(gè)鱗片的底部都有一個(gè)類似于毛囊的功能。此外，斑馬魚(yú)也不存在皮脂腺。盡管存在這些差異，但斑馬魚(yú)皮膚的整體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物皮膚還是相似的，非常適合研究人類皮膚疾病。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，71.4%的人類蛋白質(zhì)編碼基因和82%的致病基因具有明確的斑馬魚(yú)同源物。其中包括與人類疾病相關(guān)的眾多皮膚基因的同源基因，如表皮標(biāo)記物BPAG1、PLEC1、角蛋（K）基因K1和K5，以及眾多整合素和膠原編碼基因。目前，遺傳工具的發(fā)展和高效基因工程方法（如CRISPR/Cas9）的最新進(jìn)展允許精確操縱致病基因和快速開(kāi)發(fā)新的疾病模型。這些工具與保守性良好的遺傳學(xué)相結(jié)合，可以直接創(chuàng)建新的組織特異性報(bào)告基因和疾病建模突變體。此外，斑馬魚(yú)還具有理想的光學(xué)特性，以及斑馬魚(yú)快速的體外發(fā)育和水媒藥物給藥優(yōu)勢(shì)使得高通量藥物篩選成為可能。
斑馬魚(yú)模型在皮膚疾病研究中的進(jìn)展
斑馬魚(yú)模型在先天性皮膚病中的研究進(jìn)展
斑馬魚(yú)是研究先天性皮膚病的實(shí)用平臺(tái)，特別適合研究遺傳性色素沉著不足和色素沉著過(guò)度的疾病。色素沉著癥，包括白化病、斑疹病和Waardenburg綜合征等，是由控制黑素細(xì)胞功能基因的不同程度損傷引起的?？刂坪谒丶?xì)胞發(fā)育的機(jī)制在斑馬魚(yú)中保守得很好，而在斑馬魚(yú)的直系物中發(fā)生突變色素產(chǎn)生基因顯示低色素沉著表型。
Waardenburg 綜合征是一種聽(tīng)覺(jué)色素障礙，由神經(jīng)嵴形成和黑素細(xì)胞發(fā)育所必需的基因突變引起。斑馬魚(yú)和人類一樣，sox10或mitfa的缺失會(huì)導(dǎo)致色素沉著缺陷和黑素細(xì)胞缺乏。同源基體的缺失導(dǎo)致黑素細(xì)胞存活和遷移的缺陷，這是在人類疾病中看到的模式的假設(shè)原因。以頭發(fā)和皮膚缺乏色素沉著為典型的白化病，是由色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因如TYR和恰當(dāng)命名的OCA2突變引起的。這些基因的斑馬魚(yú)同源基因突變導(dǎo)致斑馬魚(yú)色素脫色，反映了人類疾病的遺傳/表型關(guān)系。
大皰性表皮松解癥（Epidermolysis bullosa, EB）是一組罕見(jiàn)的遺傳性皮膚病，其特征是皮膚易碎起泡。這些水泡是由構(gòu)成皮表皮復(fù)合物并控制表皮粘連的結(jié)構(gòu)蛋白缺乏引起的。由于其保守的表皮和真皮結(jié)構(gòu)，斑馬魚(yú)是EB的合適模型。斑馬魚(yú)基底表皮結(jié)構(gòu)缺陷的第一個(gè)模型是pen/lgl2突變體。這些喪失功能的突變體不能形成基底半粒，導(dǎo)致皮膚脫離基底膜和表皮過(guò)度增生，令人聯(lián)想到人類EB。盡管該突變體表皮過(guò)度增生方面已被用于牛皮癬模型，但表皮/真皮粘附的破壞使該模型與EB最相似。隨后的研究利用反向遺傳學(xué)來(lái)靶向與人類EB相關(guān)的基因。隨著利用斑馬魚(yú)建立EB模型開(kāi)始，未來(lái)的研究可以將新的基因敲除模型與小分子上位實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以闡明EB發(fā)病機(jī)制。
此外，斑馬魚(yú)模型也有助于理解另外兩種與mapk信號(hào)相關(guān)的疾?。?/span>Noonan綜合征和LEOPARD綜合征，以及被用來(lái)模擬先天性色素沉著癥，并引出支撐其生物學(xué)的機(jī)制。2016年，Thomas 等人發(fā)現(xiàn)，眼部黑色素瘤驅(qū)動(dòng)GNAQ和GNA11的嵌合表達(dá)驅(qū)動(dòng)了色素血管斑狀病中發(fā)現(xiàn)的先天性色素沉著。
斑馬魚(yú)模型在免疫介導(dǎo)和炎癥性疾病中的研究進(jìn)展
白癜風(fēng)是一種以自身免疫介導(dǎo)的表皮黑素細(xì)胞破壞為特征的疾病，最近一直是斑馬魚(yú)建模嘗試的主題。2018年，Zhou 等人研究了應(yīng)激誘導(dǎo)的IL17和IL1β表達(dá)在促進(jìn)白癜風(fēng)中發(fā)生的黑素細(xì)胞破壞中的作用。IL-17治療發(fā)育中的斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)導(dǎo)致線粒體功能障礙和黑色素生成抑制，推測(cè)是通過(guò)kc衍生的IL1b表達(dá)。另一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了對(duì)γ分泌酶復(fù)合物亞基nicastrin的敲除。已經(jīng)確定伽馬分泌酶促進(jìn)NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)，而NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)是正常色素沉著所必需的。與人類白癜風(fēng)相似，這些nicastrin 缺乏的動(dòng)物表現(xiàn)出皮膚炎癥。然而，與免疫細(xì)胞可能導(dǎo)致黑素細(xì)胞死亡的白癜風(fēng)不同，在這些突變體中，nicastrin缺乏導(dǎo)致黑素細(xì)胞壞死，這可能會(huì)招募免疫細(xì)胞。這些研究為KCs、細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞和黑素細(xì)胞在皮膚炎癥中的作用提供了有趣的見(jiàn)解。
銀屑病與白癜風(fēng)相似，是一種復(fù)雜的免疫介導(dǎo)疾病。銀屑病的特征不是黑素細(xì)胞的破壞，而是KCs的過(guò)度增殖。KC增生導(dǎo)致紅斑斑塊鱗屑，全世界約有3%的人發(fā)生KC增生。2008年，Webb等人在描述atp1b1a突變體時(shí)，建立了最早的斑馬魚(yú)銀屑病模型之一，該突變體是從乙基甲磺酸篩選中獲得的。這些突變體喪失了atp1b1a的功能，表現(xiàn)出廣泛的表皮過(guò)度增殖和KC分化缺陷，導(dǎo)致表皮細(xì)胞聚集，這是人類銀屑病的所有關(guān)鍵特征。其他研究試圖模擬銀屑病的免疫成分。一系列研究建立了 spint1a缺失導(dǎo)致皮膚中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和KC-KC接觸缺失的模型。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)引起慢性炎癥和最終的KC增殖，都是人類銀屑病的特征。這些研究建立了實(shí)時(shí)理解和可視化促炎和促增殖事件的模型，這對(duì)于更好地了解人類銀屑病的發(fā)病機(jī)制將是非常寶貴的。
斑馬魚(yú)模型在傷口修復(fù)中的研究進(jìn)展
傷口修復(fù)對(duì)于創(chuàng)傷、糖尿病、感染和許多其他疾病引起的傷口的恢復(fù)至關(guān)重要。修復(fù)需要復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)事件來(lái)恢復(fù)適當(dāng)?shù)慕M織功能和體內(nèi)平衡。損傷檢測(cè)、傷口閉合、急性瘢痕形成和亞急性傷口愈合的快速級(jí)聯(lián)以精心安排的方式發(fā)生。這些過(guò)程需要KCs、成纖維細(xì)胞和常駐免疫細(xì)胞之間的協(xié)調(diào)。斑馬魚(yú)是一種高度再生的物種，能夠再生它們的鰭、黑素細(xì)胞、皮膚、軸突，甚至心臟。由于其再生能力、光學(xué)透明度和保守的皮膚結(jié)構(gòu)，斑馬魚(yú)模型對(duì)控制這些過(guò)程的機(jī)制產(chǎn)生了獨(dú)特的見(jiàn)解。
第一個(gè)斑馬魚(yú)受傷模型使用尾鰭截肢，其中遠(yuǎn)端三分之二的鰭被剪斷并在接下來(lái)的幾周內(nèi)再生。2009年，Niethammer 等人利用過(guò)氧化氫（H2O2）基因編碼輻射傳感器來(lái)可視化魚(yú)鰭截肢后產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)ROS梯度。他們發(fā)現(xiàn)，需要Nox/duo介導(dǎo)的H2O2生產(chǎn)爆發(fā)才能將白細(xì)胞招募到傷口部位。其他研究證實(shí)，ROS的產(chǎn)生對(duì)于代償性增殖和適當(dāng)?shù)啮捲偕陵P(guān)重要。類似的研究已經(jīng)闡明了另一種先天免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞的作用。2014年，Petrie 等人發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞被招募到傷口部位，通過(guò)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞殺傷來(lái)敲除巨噬細(xì)胞譜系會(huì)導(dǎo)致傷口愈合和尾鰭再生受損。四環(huán)素誘導(dǎo)工具（TetON）也被用于研究斑馬魚(yú)的尾鰭再生。Wehner 等人使用TetON系統(tǒng)證明 WNT 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)再生至關(guān)重要。
最近的研究也試圖將皮膚損傷和愈合的建模擴(kuò)展到尾鰭截肢之外模型。Richardson等人開(kāi)發(fā)了第一個(gè)真皮再生模型，當(dāng)時(shí)他們用皮膚科激光創(chuàng)建了全層傷口。后來(lái)通過(guò)利用斑馬魚(yú)鱗片的脫毛來(lái)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)皮膚的部分厚度傷口，對(duì)該模型進(jìn)行了擴(kuò)展。Chen等人設(shè)計(jì)了一種CreER-based系統(tǒng)，用于跟蹤再生過(guò)程中的單個(gè)上皮細(xì)胞。這個(gè)強(qiáng)大的系統(tǒng)使得再生過(guò)程中個(gè)體遷移和增殖KCs的活體成像成為可能。
斑馬魚(yú)模型在黑色素瘤中的研究進(jìn)展
黑色素瘤是一種致命的黑色素細(xì)胞惡性腫瘤，是大多數(shù)皮膚癌死亡的原因，全球每年有近6萬(wàn)名患者死亡。盡管大多數(shù)皮膚黑色素瘤在早期階段被診斷和切除，但進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性疾病的黑色素瘤的預(yù)后很差。新的小分子和免疫療法改善了患者的預(yù)后，但仍有相當(dāng)一部分患者死于黑色素瘤，這突顯了對(duì)黑色素瘤形成有更深入了解的必要性。
為了建立第一個(gè)人類黑色素瘤的斑馬魚(yú)模型，Patton等人在腫瘤抑制因子p53功能喪失、p53（lf）突變體的黑色素細(xì)胞中表達(dá)人類癌基因BRAFV600E。這些Tg（mitfa：BRAFV600E）；p53（lf）斑馬魚(yú)產(chǎn)生的腫瘤在組織病理學(xué)上反映了人類黑色素瘤。自從這一具有里程碑意義的發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其他人類基因，如NRASQ61K，已被用于設(shè)計(jì)斑馬魚(yú)皮膚黑色素瘤模型。通過(guò)比較人類黑色素瘤和斑馬魚(yú)黑色素瘤模型的遺傳特征，還發(fā)現(xiàn)了對(duì)疾病進(jìn)展至關(guān)重要的關(guān)鍵黑色素瘤修飾基因。這些研究和使用斑馬魚(yú)來(lái)模擬人類黑色素瘤已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。
斑馬魚(yú)模型在異種移植和藥物篩選中的研究進(jìn)展
斑馬魚(yú)異種移植是了解皮膚癌疾病進(jìn)展和治療的關(guān)鍵工具（圖1）。它們的透明性、可用的轉(zhuǎn)基因報(bào)告者以及缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)使得斑馬魚(yú)胚胎成為進(jìn)行異種移植的方便系統(tǒng)。此外，它們的小體積、高繁殖力和高繁殖力有利于高通量藥物篩選。除了在異種移植藥物篩選方面的應(yīng)用外，利用細(xì)胞特異性報(bào)告子對(duì)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)進(jìn)行藥物篩選已被用于發(fā)現(xiàn)癌基因（如 PRL3）的新功能或鑒定神經(jīng)嵴的小分子調(diào)節(jié)因子。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出新的成年斑馬魚(yú)異種移植模型，可以在穩(wěn)定的成年環(huán)境中長(zhǎng)期植入和研究腫瘤生物學(xué)。這些工具允許為罕見(jiàn)的黑色素瘤亞型創(chuàng)建新的模型，并以快速的方式測(cè)試新的治療方法。這些篩選可以與小鼠研究相結(jié)合，以進(jìn)一步闡明疾病和治療的保守機(jī)制。總之，這些模型為利用斑馬魚(yú)了解皮膚癌的發(fā)生、進(jìn)展和治療機(jī)制提供了一個(gè)全面的科研武器庫(kù)。
圖1 用于斑馬魚(yú)研究皮膚過(guò)程和病理的技術(shù)選擇
結(jié)語(yǔ)
斑馬魚(yú)可以作為合適的動(dòng)物模型以擴(kuò)大我們對(duì)皮膚疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制的理解并在皮膚病學(xué)中開(kāi)發(fā)新的治療策略。由于其低維護(hù)成本、高度保守的基因組和易于遺傳操作，斑馬魚(yú)是皮膚科實(shí)驗(yàn)室臨床前研究的優(yōu)秀模型，填補(bǔ)了體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)哺乳動(dòng)物模型之間的空白，為人類皮膚病建模和開(kāi)發(fā)未來(lái)的治療方法提供了更大的機(jī)會(huì)。
以上部分內(nèi)容參考自《Journal of Investigative Dermatology》發(fā)表的William Tyler Frantz、Craig J. Ceol題為“Research Techniques Made Simple：Zebrafifish Models for Human Dermatologic Disease”的文獻(xiàn)。
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