好看的小说,我欲封天

0512-8957 3668 / 18013764755

消化內(nèi)科 | 斑馬魚模型在消化系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用

來源: | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2023-07-22 | 2075 次瀏覽 | 分享到:

消化系統(tǒng)疾病是指發(fā)生在口腔、唾液腺、食管、胃、腸、膽、胰腺、腹膜及網(wǎng)膜等臟器的疾病，包括消化器官的器質(zhì)性和功能性疾病。隨著生活方式、生活環(huán)境的改變及人口老齡化進(jìn)程加速，消化系統(tǒng)疾病發(fā)病率逐年上升，成為新時(shí)代常見病。由此引發(fā)的消化道惡性腫瘤高發(fā)現(xiàn)象，皆表明消化系統(tǒng)疾病的防治不可小覷。而由于消化系統(tǒng)疾病類別繁多，一直以來缺乏防控能力評估標(biāo)準(zhǔn)，消化領(lǐng)域診療發(fā)展存在巨大挑戰(zhàn)。

前言

明確消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的分子機(jī)制對疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。斑馬魚是一種獨(dú)特的活體脊椎動物模型，與人類基因高度保守，早期胚胎透明，有助于對發(fā)育過程的實(shí)時(shí)觀測。且斑馬魚器官及組織的癌變與人類極為相似，為腫瘤的發(fā)展、抗腫瘤藥物的開發(fā)和篩選、最佳治療方案的確定等提供了較好的腫瘤模型，如斑馬魚肝癌模型、結(jié)直腸模型、胰腺癌模型、胃癌模型等。此外，斑馬魚模型在遺傳、分子機(jī)制以及藥物篩選研究中展現(xiàn)出巨大的潛力，使之受到越來越廣泛的關(guān)注與重視。本文主要總結(jié)了斑馬魚模型在消化系統(tǒng)疾病研究中的優(yōu)勢，以及以斑馬魚建立的消化系統(tǒng)疾病及腫瘤模型的應(yīng)用進(jìn)展。

斑馬魚模型在消化系統(tǒng)疾病研究中的優(yōu)勢

01轉(zhuǎn)基因技術(shù)和成像技術(shù)的獨(dú)特性

在斑馬魚中，有眾多細(xì)胞特異性啟動子驅(qū)動熒光蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，利用活體成像可以對消化道和其他組織中的細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)控，這為消化系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了更好的視角。Silva 等利用中性粒細(xì)胞熒光報(bào)告基因斑馬魚及其幼體檢測急性炎癥反應(yīng)，根據(jù)白細(xì)胞炎癥指數(shù)對抗炎或者促炎化合物進(jìn)行分類，篩選出兩種具有良好抗炎作用的膳食酚酸（沒食子酸以及阿魏酸）。

02低成本高效率

相對于小鼠動物模型，斑馬魚更易養(yǎng)殖，減少了實(shí)驗(yàn)支出。此外，斑馬魚三個(gè)半月即可達(dá)到性成熟，消化系統(tǒng)在受精5天后即可發(fā)育成熟并正常運(yùn)作。一對斑馬魚一次可產(chǎn)200-300顆卵，間隔4-7天，又可進(jìn)行下一次交配。這為消化系統(tǒng)疾病藥物篩選和藥物測試提供充足的實(shí)驗(yàn)動物，大大縮短了試驗(yàn)周期。同時(shí)，斑馬魚胚胎透明，體外受精，直接生活在水環(huán)境中，使魚暴露在化學(xué)物質(zhì)或者微生物的實(shí)驗(yàn)更易于進(jìn)行。

03斑馬魚與哺乳動物消化系統(tǒng)的相似性

斑馬魚與人類基因的同源性達(dá)87%，且與人類有高度相似的消化系統(tǒng)，肝臟、膽囊、胰腺和腸道也具有類似的吸收和分泌功能。同時(shí)，斑馬魚的腸道發(fā)育在受精后18小時(shí)開始，內(nèi)胚層細(xì)胞開始極化，隨后是節(jié)段管腔的形成，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的漸進(jìn)式形態(tài)發(fā)生和分化，在受精后5天腸道發(fā)育完全。這與哺乳動物腸道發(fā)育時(shí)間順序相同，都是先發(fā)育腸的吻側(cè)部分，隨后是后腸和中腸。此外，斑馬魚前中腸段在功能上類似于哺乳動物的小腸，后段則與哺乳動物大腸具有相同的特征。這都為利用斑馬魚模式生物研究人類消化系統(tǒng)疾病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

04斑馬魚作為消化道腫瘤研究模型的獨(dú)特優(yōu)勢

斑馬魚腫瘤模型是近年興起的一種活體脊椎動物模型，是目前最有前景的模式生物之一，能夠自發(fā)產(chǎn)生與人類性質(zhì)相似的腫瘤。斑馬魚具有獨(dú)特的優(yōu)勢：胚胎透明，研究人員可實(shí)時(shí)觀察和追蹤癌細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和血管生成；轉(zhuǎn)基因斑馬魚casper及免疫缺陷斑馬魚成年后仍可保持透明狀態(tài)，這使得斑馬魚腫瘤模型的應(yīng)用不僅局限于其胚胎及幼魚；可用于大規(guī)?；蚝Y選和活體高通量藥物篩選；在人源性腫瘤異種移植（patient-derivedxenograft，PDX）中，斑馬魚 PDX（zPDX）成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、所需樣本數(shù)量?。ㄍǔＣ總€(gè)斑馬魚胚胎需要100～200個(gè)細(xì)胞）。斑馬魚消化道腫瘤模型是一種適合從起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移到移植的活體動物模型。目前通過轉(zhuǎn)基因、基因組編輯技術(shù)、異種移植、藥物誘導(dǎo)的毒性損傷等方法，已經(jīng)建立了多種斑馬魚消化道腫瘤模型。

斑馬魚模型在消化系統(tǒng)疾病研究中的進(jìn)展

斑馬魚模型在炎癥性腸病中的研究進(jìn)展

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD）。近20年來的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全世界范圍內(nèi)IBD發(fā)病率呈現(xiàn)驚人的上升趨勢。IBD病程漫長、易反復(fù)，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致癌變。IBD發(fā)病原因復(fù)雜，其中主要包括遺傳基因易感性、腸道共生菌群紊亂、免疫反應(yīng)失調(diào)以及環(huán)境誘因等。隨著對IBD發(fā)病機(jī)制的深入研究，其基礎(chǔ)和臨床研究都取得了長足的進(jìn)展，但要根治IBD，還需對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。在IBD發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)和靶向治療研究中，疾病模型的建立是很重要的環(huán)節(jié)。

斑馬魚模型在IBD發(fā)病的遺傳、分子機(jī)制以及藥物篩選研究中展現(xiàn)出巨大的潛力，使之受到越來越廣泛的關(guān)注與重視。根據(jù)模型的不同構(gòu)建方式可以分為化學(xué)誘導(dǎo)模型、基因工程模型、細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型和基因突變模型。其中，化學(xué)誘導(dǎo)模型不需要進(jìn)行基因篩選和繁殖傳代，耗時(shí)少。處理方式主要是通過浸泡和腸道給藥，易操作。所用藥物易得，價(jià)格便宜，成本小。更重要的是，化學(xué)誘導(dǎo)模型模擬人類IBD典型臨床癥狀的同時(shí)，也具備一些關(guān)鍵免疫學(xué)和組織病理學(xué)特征。因此，化學(xué)誘導(dǎo)模型是最常用并且應(yīng)用最廣泛的模型。按照處理的化學(xué)藥物不同，斑馬魚IBD模型主要有三種：葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的IBD模型、唑酮誘導(dǎo)的IBD模型和2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的IBD模型。

斑馬魚IBD模型在模擬重復(fù)腸損傷和修復(fù)方面具有突出優(yōu)勢，其中使用最廣泛IBD模型就是由DSS誘導(dǎo)的。用DSS處理受精后三天的斑馬魚幼體，會導(dǎo)致細(xì)菌過度增長，中性粒細(xì)胞滲入腸道，促炎基因上調(diào)，以及細(xì)胞增殖整體被抑制，這與腸道菌群失調(diào)及DSS破壞腸黏膜屏障有關(guān)。此模型多用于潰瘍性結(jié)腸炎病理機(jī)制及篩選治療藥物方面的研究。與DSS誘導(dǎo)慢性小鼠IBD模型需要幾個(gè)月的建模周期不同，斑馬魚中重復(fù)性DSS損傷明顯不能完全恢復(fù)、死亡率增加、黏液生成受損、自噬受損，這些都在兩周之內(nèi)發(fā)生。Huang等利用DSS誘導(dǎo)斑馬魚IBD模型探究了益生菌對IBD緩解和預(yù)防的積極作用，以及益生菌治療IBD的有效性和安全性，建立了一種快速篩選益生菌候選菌的方法，并篩選出一株保護(hù)效果最好的菌——史密斯芽孢桿菌XY1。Di Paola等用DSS誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚腸炎研究表明，棕櫚酰乙醇酰胺唑啉可降低DSS誘導(dǎo)的腸道損傷和黏液產(chǎn)生，并可以降低炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。

唑酮誘導(dǎo)的斑馬魚小腸結(jié)腸炎模型與相應(yīng)的小鼠有很高的相似性，但是它的使用僅限于成年的、不透明的斑馬魚。TNBS誘導(dǎo)的模型具有造模時(shí)間短、可重復(fù)、易于誘導(dǎo)等優(yōu)點(diǎn)，既可以模擬急性炎癥反應(yīng)，也可以模擬慢性炎癥反應(yīng)，是經(jīng)典的IBD動物模型，主要用于克羅恩病的研究。TNBS可以誘導(dǎo)幼年斑馬魚，也可以誘導(dǎo)成年斑馬魚。處理斑馬魚幼魚時(shí)，把受精后3天的斑馬魚幼魚浸泡在TNBS中處理五天，則出現(xiàn)TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的特征；TNBS處理成年斑馬魚時(shí)，直腸內(nèi)給藥，6小時(shí)后，腸內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤，造成腸血管系統(tǒng)破壞、中腸縮短、腸蠕動消失、腸道絨毛長度縮短等?？赡?/span>由于TNBS為半抗原物質(zhì)，可與大分子組織蛋白結(jié)合成為抗原，引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致類似于IBD的癥狀。Uyttebroek 等使用TNBS誘導(dǎo)的IBD斑馬魚模型研究表明，斑馬魚的遠(yuǎn)腸段中膽堿能神經(jīng)元比例顯著降低，整個(gè)腸道中血清素能神經(jīng)元的比例在炎癥期間顯著增加。

消化道腫瘤發(fā)病隱匿、早期診斷困難、缺乏有效的治療手段，其發(fā)病率及死亡率均處于較高水平。截至2012年，全國惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率位居首位的是肺癌，其次為胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌和食管癌。因此，了解消化道腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)對其治療具有重要意義。斑馬魚的腫瘤模型已被廣泛應(yīng)用于識別腫瘤生物標(biāo)記物、尋找新的藥物治療靶點(diǎn)，其研究正開始為指導(dǎo)個(gè)性化的臨床應(yīng)用鋪平道路。

斑馬魚在消化道腫瘤中的研究進(jìn)展-肝癌

肝癌的發(fā)生是多因素（肝炎病毒感染、黃曲霉素中毒、過度飲酒、非酒精性脂肪肝病等）、多基因（抑癌基因TP53、抑癌基因PTEN等）、多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（RB1、p53、Wnt 等途徑）的復(fù)雜過程。在我國，乙型肝炎病毒慢性感染是原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要原因，乙肝病毒誘發(fā)肝癌的發(fā)生與染色體突變及特定致癌途徑的激活有關(guān)。斑馬魚肝癌基因與人類有著高度的保守性。

研究表明，在p53轉(zhuǎn)基因斑馬魚突變體模型中，乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X antigen，HBx）和酪氨酸激酶src的過度表達(dá)可導(dǎo)致斑馬魚肝臟組織癌變，與人類肝癌的形成機(jī)制相似。在原癌基因Myc轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，Myc表達(dá)升高能夠?qū)е赂渭?xì)胞增殖、腺瘤形成及癌變。Myc轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝癌模型的分子特征與小鼠肝癌模型及人類肝癌分子特征相似。Nguyen等采用米非司酮誘導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，實(shí)現(xiàn)了肝臟中致癌基因kras^V12的表達(dá)。米非司酮誘導(dǎo)后可導(dǎo)致肝臟腫瘤的發(fā)生，而撤銷誘導(dǎo)腫瘤則消退。分子檢測結(jié)果表明，在krasV12介導(dǎo)的肝腫瘤過程中，Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR信號通路都被激活。使用ERKl/2特異性抑制劑PD98059聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002或mTOR選擇性抑制劑雷帕霉素阻斷這兩種信號通路后，轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟增殖受到明顯抑制，此研究為針對Ras信號的分子靶向治療提供了理論依據(jù)。

目前，基于肝癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明且治療方法有限，斑馬魚肝癌模型中分子信號通路的研究可為探索人類肝癌發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的治療提供重要的參考依據(jù)。

斑馬魚在消化道腫瘤中的研究進(jìn)展-結(jié)直腸癌

在斑馬魚的一生中，自發(fā)性腸道腫瘤并不常見。目前，斑馬魚腸道腫瘤模型多為異種移植。崔戈等利用骨形成蛋白和激活素跨膜抑制劑基因（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620，構(gòu)建了一種人結(jié)直腸癌異種移植斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)BAMBI基因可顯著促進(jìn)此模型中人結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。Fiors 等利用5例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除樣本建立zPDX，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞能夠在斑馬魚中增殖并生成新血管。根據(jù)國際結(jié)腸癌治療指南，選用FOLFOX（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶）及FOLFIRI（伊立替康+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶）方案分別對患者及對應(yīng)的zPDX進(jìn)行藥物干預(yù)，分析發(fā)現(xiàn)二者之間的相關(guān)性達(dá)4/5。該研究表明，zPDX可用于篩選治療方案、制定個(gè)體化治療。斑馬魚已成為研究腸道腫瘤的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?

斑馬魚在消化道腫瘤中的研究進(jìn)展-胰腺癌

在90%的胰腺癌中可發(fā)現(xiàn)K-RAS癌基因突變，Ras/Raf/MEK/ERK通路對癌細(xì)胞的增殖、凋亡和分化具有深遠(yuǎn)影響，該通路可被MEK抑制劑有效抑制。在由K-RAS引發(fā)的斑馬魚胰腺癌模型中，Gal4/UAS轉(zhuǎn)基因體系被廣泛應(yīng)用。此系統(tǒng)能夠評估K-RAS基因突變造成的不同影響，以及蛋白質(zhì)改變對K-RAS 基因的影響，可精準(zhǔn)識別腫瘤治療策略的新靶點(diǎn)。利用Gal4/UAS系統(tǒng)能夠研究參與胰腺癌發(fā)病過程的TGFβ、Wnt、Notch和Hedgehog等信號通路。

斑馬魚在消化道腫瘤中的研究進(jìn)展-胃癌

胃癌是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病之一。我國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，胃癌在男性腫瘤中高居第二，女性腫瘤中位居第三，是我國癌癥死亡的第二大原因。近年來，盡管靶向藥物的應(yīng)用在一定程度上改善了胃癌的預(yù)后，但晚期胃癌患者的平均存活時(shí)間仍不到12個(gè)月，5年生存率低至20%，這可能是由高異構(gòu)性或其他未知機(jī)制導(dǎo)致的化療不敏感或耐藥所致。

斑馬魚沒有胃及表達(dá)特定胃功能的基因，但在斑馬魚胃癌異種移植模型中，胃癌細(xì)胞在斑馬魚胚胎中的存活、血管生成、遷移及相關(guān)分子的表達(dá)都與人類有著較高相似性。有研究利用胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織成功建立了胃癌zPDX模型，14例組織樣本中有9例成功移植到斑馬魚胚胎中，5例因組織細(xì)胞不易解離導(dǎo)致針狀堵塞及移植失敗，移植成功率達(dá)64%，比胃癌小鼠PDX模型中報(bào)告的（34%）要高得多，且所有胃癌組織樣本在活胚胎中都表現(xiàn)出增殖、血管生成及轉(zhuǎn)移潛力。

斑馬魚模型在腫瘤藥物篩選中的研究進(jìn)展

斑馬魚腫瘤移植模型已廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因功能的研究與抗腫瘤藥物的篩選，可在短時(shí)間內(nèi)為患者提供個(gè)體化精準(zhǔn)治療的信息，進(jìn)而選擇對患者最有效的治療方法。

勞喬聰?shù)确謩e應(yīng)用胃癌、肝癌細(xì)胞株構(gòu)建了zPDX模型，使用紫杉醇、伊立替康、羥基脲、順鉑和5-氟尿嘧啶干預(yù)胃癌zPDX模型，阿霉素、吉西他濱、羥基脲、順鉑和5-氟尿嘧啶干預(yù)肝癌zPDX模型，發(fā)現(xiàn)臨床上效果顯著的抗癌藥物在zPDX模型中同樣可抑制癌細(xì)胞的生長，同時(shí)顯現(xiàn)出治療效果的優(yōu)劣之分。Wu等應(yīng)用胃癌zPDX進(jìn)行臨床前藥物敏感性研究，發(fā)現(xiàn)不同患者的胃癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶、多烯紫杉醇、阿帕替尼三種化療藥物的敏感性不。

zPDX能夠直接觀察到抗癌藥物對腫瘤細(xì)胞的影響，可用于臨床前藥物篩選，甚至能夠在臨床中實(shí)時(shí)選擇化療藥物，可能成為臨床前實(shí)驗(yàn)的第一步，為篩選藥物、制定個(gè)體化治療方案、促進(jìn)精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的發(fā)展提供一個(gè)很有前景的平臺。

結(jié)語

通過斑馬魚體型小、產(chǎn)卵多、胚胎透明、試驗(yàn)周期短、成本低、基因操作技術(shù)應(yīng)用方便等方面的優(yōu)勢，以及斑馬魚和人類在基因和免疫方面的相似性，使斑馬魚在消化系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和治療研究方面顯示出巨大的價(jià)值，在藥物篩選、開發(fā)新藥、制定個(gè)體化治療方案的研究方面也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。此外，zPDX消化道腫瘤模型的建立也有助于人類對消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制、靶向和個(gè)體化治療有更深的見解，為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。