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原名：BDE-47 Causes Depression-like Effects in Zebrafish Larvae via a Non-Image-Forming Visual Mechanism

雜志：Environmental Science & Technology

影響因子：11.4（2022）

年份：2023

通訊作者：Ting Xu

摘要

抑郁癥是一種高發(fā)病率的情緒障礙，常伴有睡眠障礙，可由非圖像形成（NIF）視覺(jué)系統(tǒng)觸發(fā)。因此，我們假設(shè)已知多溴化二苯醚可誘導(dǎo)視覺(jué)障礙，可以通過(guò)破壞NIF視覺(jué)通路來(lái)促進(jìn)抑郁。在本研究中，將斑馬魚幼蟲暴露于環(huán)境相關(guān)濃度（2.5和25 μg/L）的BDE-47中。BDE-47引起的黑視素基因主導(dǎo)了NIF視覺(jué)系統(tǒng)，在夜間下降（p < 0.05），但在早晨上升（p < 0.05）。這種雙向差異傳遞到視交叉上核中的時(shí)鐘基因和神經(jīng)肽，并影響了鄰近的血清素系統(tǒng)。然而，抑郁的指示性因素，包括serta、htr1aa和aanat2，單向增加了1.3-1.6倍（p < 0.05）。它們與夜間趨同性增加（p < 0.05）和晝夜節(jié)律活動(dòng)減退（p < 0.05）相一致。黑視素拮抗作用的結(jié)果也表明，這些結(jié)果可能是由于黑視素的直接光同步和由黑視素引起的晝夜節(jié)律中斷的結(jié)合?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究結(jié)果顯示，BDE-47暴露破壞了NIF視覺(jué)通路，導(dǎo)致抑郁樣效應(yīng)，這可能進(jìn)一步加深對(duì)健康影響，如情緒障礙。

關(guān)鍵詞：黑視素，非圖像形成，抑郁，BDE-47，晝夜節(jié)律，睡眠

前言

抑郁癥是世界范圍內(nèi)最大的健康挑戰(zhàn)之一，而抑郁癥的發(fā)病率在幾十年來(lái)不斷上升。雖然單胺類神經(jīng)遞質(zhì)理論仍然是抑郁癥病理生理學(xué)中的主要假說(shuō)，但單胺能藥物的有效性和可靠性還遠(yuǎn)不能令人滿意。據(jù)此，新的致病因素如晝夜節(jié)律被提出。抑郁癥患者通常表現(xiàn)出有規(guī)律的日間情緒變化和生理振蕩，以及睡眠障礙。在一項(xiàng)研究中，超過(guò)三分之二的抑郁癥兒童經(jīng)歷了明顯的睡眠異常，而在另一項(xiàng)縱向流行病學(xué)研究中，兒童睡眠問(wèn)題顯著預(yù)示著更高的抑郁水平。對(duì)于成年人來(lái)說(shuō)，一項(xiàng)橫斷研究獲得了睡眠時(shí)間和抑郁之間很強(qiáng)的U型關(guān)聯(lián)，表明睡眠不足和睡眠過(guò)度都可能顯著增加抑郁風(fēng)險(xiǎn)。時(shí)間療法，特別是光療法，也成為流行的臨床治療方法，可以獨(dú)立使用或與抑郁癥藥物一起使用。

光療法的原理利用了非圖像形成（NIF）視覺(jué)，這種新發(fā)現(xiàn)的視覺(jué)系統(tǒng)的功能不同于著名的圖像形成視覺(jué)。NIF通路主要依賴于本質(zhì)上具有光敏性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（ipRGCs），它們利用黑視素作為信號(hào)光色素，并投射到十幾個(gè)大腦區(qū)域。例如，帶有黑視素的ipRGCs可以直接光引導(dǎo)外側(cè)系帶和伏隔核的一些情緒相關(guān)的腦區(qū)域，或通過(guò)主要靶點(diǎn)“主生物鐘”視交叉上核（硫氰酸鹽）影響這些區(qū)域。在上述過(guò)程中，黑視素通常與褪黑素建立聯(lián)系。褪黑激素是松果體釋放的一種與晝夜節(jié)律相關(guān)的激素，在夜間產(chǎn)生，以增加人類和日間動(dòng)物的睡眠傾向。在一些抑郁癥患者中，褪黑激素的分泌已被顯示為異常水平和相移，其合成也可以在短波長(zhǎng)光下被夜間黑視素激活顯著抑制。黑視素在情緒和晝夜節(jié)律障礙中的因果作用已被最近的光污染研究進(jìn)一步證實(shí)。因此，我們有理由合理地推測(cè)，這種視網(wǎng)膜-大腦通路會(huì)被化學(xué)污染物破壞。

多溴二苯醚（PBDEs）在受到斯德哥爾摩公約的限制之前，已被廣泛用作阻燃劑。由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，PBDEs仍然普遍存在于環(huán)境中。受污染水中的PBDEs含量高達(dá)29 μg/L，并且通常在生物群樣品中檢測(cè)到μg/g到mg/g干重水平。因此PBDEs長(zhǎng)期健康的后果仍然不可忽視。PBDEs的不良反應(yīng)多樣且復(fù)雜，其特征是甲狀腺內(nèi)分泌紊亂、生殖毒性和視力障礙。大量的研究都集中在PBDEs的神經(jīng)毒性上，特別是在生命的早期階段。多項(xiàng)隊(duì)列研究報(bào)道了PBDEs與抑郁癥狀之間的關(guān)系，并觀察到顯著的正相關(guān)，特別是與2,2’，4,4’-四溴修飾苯醚（BDE-47）。值得注意的是，在中國(guó)上海閔行的一項(xiàng)出生隊(duì)列研究中，4歲兒童睡眠問(wèn)題和較高的BDE-47血清水平之間存在一致的模式。在動(dòng)物研究中，PBDE損害了嚙齒動(dòng)物和斑馬魚中與抑郁相關(guān)的5-羥色胺能信號(hào)通路，包括干擾5-羥色胺能合成基因的轉(zhuǎn)錄和降低全身5-羥色胺（5-HT）水平。暴露于BDE-47的代謝物6-OH-BDE-47，也會(huì)導(dǎo)致斑馬魚幼魚大腦中5-HT免疫反應(yīng)神經(jīng)元的減少，同時(shí)TPH2（色氨酸羥化酶2）的表達(dá)減少，TPH2是5-HT合成的限速酶。

視覺(jué)障礙是PBDEs毒理學(xué)作用的一種新興類別。有大量研究表明，急性或慢性暴露于多溴二苯醚可能損害斑馬魚的圖像形成視力，并干擾視覺(jué)引導(dǎo)行為。因此，多溴二苯醚很可能會(huì)破壞斑馬魚視覺(jué)系統(tǒng)的NIF功能。我們假設(shè)，NIF系統(tǒng)的主要光色素黑視素是BDE-47的潛在靶點(diǎn)，其破壞可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到下游的晝夜節(jié)律系統(tǒng)和情緒，最終促進(jìn)抑郁。本研究旨在描述NIF系統(tǒng)在BDE-47暴露下的表現(xiàn)，特別是在白天夜晚的差異下，并驗(yàn)證黑視素在促進(jìn)斑馬魚幼蟲抑郁樣效應(yīng)中的作用模式。

材料和方法

斑馬魚的維護(hù)

本研究采用了晝夜斑馬魚模型，因?yàn)樵诳紤]光感知和晝夜節(jié)律作為心理健康的危險(xiǎn)因素時(shí)，它比夜間小鼠模型具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。選擇4~6個(gè)月齡的健康野生型斑馬魚（AB菌株）進(jìn)行產(chǎn)卵。培養(yǎng)環(huán)境保持在28.5°C，14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)，上午8點(diǎn)亮燈，晚上10點(diǎn)燈關(guān)閉。在第一個(gè)早晨光照后親代魚交配，收集受精卵用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)方案均在同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)（TJAD00122102）的指導(dǎo)和批準(zhǔn)下進(jìn)行。

BDE-47的化學(xué)暴露

根據(jù)報(bào)告的BDE-47的環(huán)境水平，將0.01% DMSO作為溶劑，BDE-47濃度設(shè)計(jì)為0、2.5和25 μg/L。在暴露期間，暴露溶液每天更新一半?？紤]到晝夜節(jié)律系統(tǒng)可能參與，我們收集晚上11點(diǎn)的5dpf斑馬魚和上午9點(diǎn)的6dpf斑馬魚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BDE-47的定量（在水和魚中）程序是基于我們之前的研究進(jìn)行了修改。

RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

每個(gè)暴露組約50只幼蟲，進(jìn)行4個(gè)生物重復(fù)，然后均質(zhì)化進(jìn)行RNA提取和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。使用TRIzol試劑（Invitrogen，美國(guó)）提取總RNA后，按照制造商的說(shuō)明，使用PrimeScript RT試劑試劑盒（Takara，日本）將樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR熱循環(huán)過(guò)程包括10 min預(yù)變性，95°C 30 s，60°C 30s，72°C 40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算化學(xué)暴露條件下基因與對(duì)照組相比的倍數(shù)變化。

免疫熒光染色

每組3個(gè)生物重復(fù)，處理組收集30只幼蟲，進(jìn)行固定，解剖，制備腦組織石蠟片。VIP（血管活性腸肽）和AVP（精氨酸加壓素）神經(jīng)肽的一抗被用于共定位SCN。下丘腦5-HT神經(jīng)元也被標(biāo)記為成像。采用ImageJ對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化和分析。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

收集幼蟲，用PBS洗滌，以去除培養(yǎng)基中褪黑素的干擾。然后，對(duì)每個(gè)標(biāo)本加入PBS，以10 mg新鮮幼蟲重量與100 μL PBS的比例勻漿，12000rpm離心20 min。收集上清液，分別使用褪黑素Elisa試劑盒（mlbio，China）和AANAT Elisa Kit（mlbio，China），按照制造商的說(shuō)明檢測(cè)褪黑素和AANAT酶的水平。同時(shí)，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Beyotime，China）檢測(cè)5個(gè)生物重復(fù)的每個(gè)標(biāo)本上清液的總蛋白量。

原位雜交

詳細(xì)的程序遵循Monje和Kim的說(shuō)明，每個(gè)暴露組有3個(gè)重復(fù)。opn4.1的克隆探針模板的引物序列為CGTGTGAAAGAGAAGGACCT（正向）和CAGTGTCACTTACGTG-ACAG（反向）。

趨化實(shí)驗(yàn)

趨化試驗(yàn)用于測(cè)試斑馬魚幼魚在突然亮燈時(shí)的抑郁樣行為。計(jì)算方法為黑暗期在外區(qū)總游泳時(shí)間的百分比（%），其趨同性水平與抑郁樣狀態(tài)呈正相關(guān)。每組至少有20只幼魚的行為數(shù)據(jù)。斑馬魚幼蟲趨化性實(shí)驗(yàn)方案是遵循Schnorr等人的工作。

睡眠/覺(jué)醒行為

考慮到睡眠障礙是抑郁癥的核心癥狀之一，在臨床試驗(yàn)和動(dòng)物研究中測(cè)量抑郁癥時(shí)，通常會(huì)報(bào)道觀察睡眠/覺(jué)醒狀態(tài)。在斑馬魚中，“類似睡眠”的狀態(tài)可以被定義為“1分鐘的不活動(dòng)”。在5 dpf時(shí)，3個(gè)處理組（每組32只）的幼蟲被轉(zhuǎn)移到96孔板上，每孔有1只幼蟲。在平板上適應(yīng)4小時(shí)后，使用斑馬魚跟蹤模塊連續(xù)測(cè)試斑馬魚幼魚的睡眠/覺(jué)醒行為。光/暗循環(huán)與繁殖環(huán)境保持一致（光照14小時(shí)：黑暗10小時(shí)），以及穩(wěn)定的環(huán)境溫度（28.5°C），以減少蒸發(fā)。

黑視素拮抗劑AA92593顯微注射

AA92593注入溶液固定濃度為10 μM，溶解于DMSO中。各組均微注射拮抗試驗(yàn)，包括兩組注射對(duì)照組（溶于10%Hank溶液的0.01%DMSO），另外兩組注射AA92593。注射行為對(duì)斑馬魚幼蟲的死亡率、畸形和孵化沒(méi)有明顯的影響。注射后，胚胎在0或25 μg/L BDE-47水暴露下培養(yǎng)。結(jié)果，拮抗試驗(yàn)中有4個(gè)處理組，包括空白注射對(duì)照組、AA92593注射對(duì)照組、空白注射BDE-47暴露組、AA92593注射BDE-47暴露組。

數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22（IBM，USA）和Matlab R2019b（MathWorks，USA）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組與BDE-47處理組之間的顯著差異采用單因素方差分析（方差分析）計(jì)算，然后采用事后Dunnett多重比較檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為p<為0.05。最終數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。使用Origin 2022b（Originlab，美國(guó)）繪制圖表。

結(jié)果

BDE47的暴露濃度

在水中暴露5天后，2.5和25 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)BDE-47暴露濃度實(shí)際分別下降到0.22和11.98 μg/L。隨著暴露BDE-47量的顯著下降可能是由于PBDEs的高生物積累。據(jù)報(bào)道，在真實(shí)環(huán)境中，BDE- 47在受污染的水中的水生濃度可高達(dá)29 μg/L，這有助于驗(yàn)證我們的濃度設(shè)置的環(huán)境相關(guān)性。同時(shí)，5 dpf幼蟲的生物區(qū)系BDE-47水平在0.12?0.48μg/g范圍內(nèi)，與之前報(bào)道的魚類常見PBDE水平（0.562?1.61μg/g）相當(dāng)甚至更低。

BDE-47干擾了幼蟲的黑視素系統(tǒng)

我們首先仔細(xì)研究了BDE-47對(duì)斑馬魚幼蟲黑視素系統(tǒng)的影響（圖1）。由于黑視素的晝夜節(jié)律相關(guān)功能，在實(shí)驗(yàn)中安排了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)：6dpf斑馬魚上午9點(diǎn)（白天）和5dpf斑馬魚晚上11點(diǎn)（晚上）。幼蟲視網(wǎng)膜組織學(xué)異常在INL、PCL、OPL、GCL各層非常明顯（圖1A），并且在25 μg/L BDE-47暴露下，晝夜均觀察到PCL紊亂。這與我們之前關(guān)于視覺(jué)視蛋白、視桿狀細(xì)胞和視錐細(xì)胞受損的發(fā)現(xiàn)一致。此外，在BDE-47暴露下，IPL層變厚。在轉(zhuǎn)錄水平上，與具有單一黑視素基因的哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚擁有兩組同源基因，非洲蟾蜍相關(guān)的opn4x（opn4xa和opn4xb)，在此不考慮，以及哺乳動(dòng)物相關(guān)的opn4（opn4a、opn4b和opn4.1），它們被證實(shí)與人類OPN4基因同源。RT-PCR結(jié)果顯示，BDE-47暴露后opn4基因表達(dá)顯著降低（圖1B），第二天早上，opn4a和opn4.1的表達(dá)量顯著增加。opn4.1的ISH檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了其在視網(wǎng)膜中的分布，并與qPCR結(jié)果一致（圖1C）。我們還檢測(cè)了5 dpf斑馬魚上午9時(shí)opn4.1的轉(zhuǎn)錄水平（圖1D）。結(jié)果證實(shí)，BDE-47暴露具有雙向的，而不是逐漸減弱的效應(yīng)，使黑視素的晝夜節(jié)律表達(dá)波動(dòng)更強(qiáng)。有趣的是，一些新發(fā)現(xiàn)的非視覺(jué)視蛋白，包括神經(jīng)蛋白酶（opn5）和兩種脊椎動(dòng)物古代視蛋白（纈草和纈草），其功能仍有待揭示，在BDE-47暴露下表現(xiàn)出類似的時(shí)間依賴性表達(dá)模式。

圖1 BDE-47擾亂黑視素系統(tǒng)（A）在BDE-47暴露下，通過(guò)H&E染色測(cè)定視網(wǎng)膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)（bars = 1 μm）。RPE、視網(wǎng)膜色素上皮；PCL、光感受器層（桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞）；OPL，外叢狀層；INL、內(nèi)核層；IPL，內(nèi)叢狀層；GCL、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。（B）BDE-47暴露條件下opn4黑視蛋白基因（opn4a、opn4b和opn4.1）的mRNA水平。結(jié)果用平均±SEM表示。每個(gè)基因的不同字母均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。(C)對(duì)opn4.1的對(duì)照組和25 μg/L BDE-47處理組的全身原位雜交（bars = 100 μm）。(D)opn4.1mRNA水平的變化趨勢(shì)。星號(hào)表示顯著性：*p < 0.05，**p < 0.01，分別比較對(duì)照組和25 μg/L BDE-47暴露組。

調(diào)節(jié)了SCN中的神經(jīng)肽和時(shí)鐘基因

BDE-47對(duì)血管活性腸多肽（VIP）和精氨酸加壓素（AVP）等神經(jīng)肽以及中央晝夜節(jié)律起搏器SCN中時(shí)鐘基因per2、clocka、cray1a和bmal1b等的影響如圖2所示。SCN的視網(wǎng)膜起始核心包含分泌VIP的神經(jīng)元，而分泌AVP的神經(jīng)元主要位于SCN殼部分，特別是對(duì)ipRGCs信號(hào)作出反應(yīng)的VIP+神經(jīng)元。在BDE-47暴露下，VIP和AVP的熒光強(qiáng)度在夜間均顯著下降，在白天均顯著升高。定量結(jié)果顯示，至少有一種BDE-47的測(cè)試濃度引起了其含量的顯著變化（圖2C）。對(duì)于時(shí)鐘基因，BDE-47在清晨導(dǎo)致per2和cry1a顯著增加（圖2A），而在夜間，進(jìn)入黑暗后不久，正晝夜節(jié)律元素時(shí)鐘顯著下降。對(duì)于上午9點(diǎn)5 dpf的測(cè)試點(diǎn)，BDE-47暴露下per2的異常振蕩（圖2B）與opn4.1（圖1D）相同?？偟膩?lái)說(shuō)，SCN中的神經(jīng)肽和時(shí)鐘基因與黑視素基因的變化趨勢(shì)相似，這表明SCN是由受影響的黑視素調(diào)節(jié)的。

圖2 BDE-47暴露影響生物鐘基因和SCN神經(jīng)肽 (A)BDE-47暴露下時(shí)鐘基因的 mRNA水平。結(jié)果用平均±SEM表示。每個(gè)基因的不同字母均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。(B)per2 mRNA水平的變化趨勢(shì)。星號(hào)表示顯著性：對(duì)照組與25 μg/L BDE-47暴露組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較時(shí)**p < 0.01，***p < 0.001。(C)SCN神經(jīng)肽AVP（綠色）和VIP（紅色）（bar=10μm）的免疫染色和統(tǒng)計(jì)分析。

中斷5-HT系統(tǒng)和抑郁相關(guān)的趨同性

受SCN在下丘腦中的位置的啟發(fā)，我們繼續(xù)研究BDE-47是否影響5-HT系統(tǒng)，而5-HT系統(tǒng)可能在調(diào)節(jié)情緒、食欲和睡眠中發(fā)揮重要作用。在25 μg/L BDE-47暴露下，5-HT主要合成基因tph2的表達(dá)在夜間顯著下降，而在白天顯著增加（圖3C），5-HT含量也有類似的變化趨勢(shì)。為了進(jìn)一步描述5-HT的變化，我們使用免疫染色法檢測(cè)了下丘腦中的5-HT水平。結(jié)果顯示，BDE-47對(duì)下丘腦5-HT的表達(dá)變化（圖3F）與tph2的表達(dá)變化一致（圖3C）。.然而，BDE-47對(duì)5- HT1A受體htr1aa和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體血清的影響表現(xiàn)出在兩個(gè)晝夜節(jié)律階段的單向趨勢(shì)（圖3D，E），這暗示了黑視素的直接參與。

趨向性測(cè)試是研究斑馬魚情緒相關(guān)行為（尤其是抑郁）的一種常用方法。我們研究了在不同光照條件下，BDE-47暴露的斑馬魚幼魚趨向性行為的變化。在從100%光照（8000 lux）切換到100%黑暗的條件下，BDE-47暴露沒(méi)有顯著差異。當(dāng)光照轉(zhuǎn)變變得對(duì)比性減弱時(shí)（從100%光照到95%黑暗），夜間的趨同性發(fā)生了顯著變化（圖3B）。只有在昏暗的光線下才會(huì)出現(xiàn)明顯的趨動(dòng)性，這與人類和斑馬魚的黑視素高度適應(yīng)光線的事實(shí)相一致;因此，在100%的黑暗下，視覺(jué)因素可能不會(huì)起重要作用。這也表明，類似抑郁的行為受到光照條件的影響，更有可能發(fā)生在夜間，這與5-HT、其受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合變化的預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 BDE-47誘導(dǎo)了趨性行為并破壞了5-HT系統(tǒng)，特別是在下丘腦（A）趨向性實(shí)驗(yàn)方案（n = 24）。(B)各組在整個(gè)試驗(yàn)階段的平均趨觸性水平。(C)tph基因 mRNA表達(dá)水平。(D)5-HT1A受體基因 mRNA表達(dá)水平。(E)serta基因mRNA表達(dá)水平。不同字母的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。(F)下丘腦5-HT的免疫染色和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（綠色熒光，bar = 30 μm）。星號(hào)表示顯著性： *p < 0.05，**p < 0.01，ns =不顯著性。

BDE-47導(dǎo)致褪黑激素的中斷和“睡眠樣”活性減退

睡眠問(wèn)題與異常的晝夜節(jié)律緊密相關(guān)，也是抑郁癥的一個(gè)標(biāo)志。因此，我們研究了BDE-47對(duì)斑馬魚褪黑素系統(tǒng)和睡眠?喚醒行為的影響。雖然褪黑素受體（mtnr1aa、mtnr1al和mtnr1bb）和一種代謝酶（aanat1）的表達(dá)與黑視素和時(shí)鐘基因相似，但在BDE-47處理后，松果體中主要的aanat2基因表現(xiàn)出晝夜單調(diào)的增加（圖4E，F(xiàn)）。因此，芳烷基胺n-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT）和褪黑素的含量一直在上升，因?yàn)锳ANAT是5-HT合成褪黑素的限速酶（圖4A，D）。我們猜測(cè)aanat2受到了黑視素的直接調(diào)控。同時(shí)，長(zhǎng)期夜間運(yùn)動(dòng)測(cè)試常被用作斑馬魚睡眠?喚醒行為的指標(biāo)，活動(dòng)不足表示“嗜睡”狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚幼魚的活動(dòng)水平下降（圖4B），在白天（70%，p<0.0.05）和夜間（88%，p < 0.001）的游泳距離顯著降低（圖4C）。結(jié)果與促進(jìn)睡眠的褪黑激素水平的改變相一致。

圖4 BDE-47破壞了褪黑激素的合成和褪黑激素的受體 (A)褪黑素的含量。結(jié)果用平均±SEM表示。星號(hào)表示顯著性： *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。(B)斑馬魚幼魚的晝夜節(jié)律活動(dòng)（5?6dpf）。(C)斑馬魚幼魚在夜間（5 dpf）和白天（6 dpf）的總游泳距離。(D)AANAT酶含量。(E)aanat基因的mRNA水平。(F)褪黑素受體基因的mRNA水平。

黑視素參與了BDE-47引起的睡眠和情緒障礙

基于htr1aa和aanat2的非節(jié)律性變化與黑視素的直接調(diào)控相關(guān)的推測(cè)，我們合子注射黑視素拮抗劑AA92593作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)一步揭示了黑視素在BDE-47誘導(dǎo)中的作用。AA92593拮抗劑療效通過(guò)上調(diào)per1b mRNA的表達(dá)水平（圖S5）和aanat2（圖5a，暗示褪黑素的增加）來(lái)證實(shí)，這與之前的報(bào)道一致。黑視素對(duì)抗aanat2表達(dá)（圖5A）和睡眠?喚醒行為（圖5B，C）可能導(dǎo)致與BDE-47誘導(dǎo)的低活性表現(xiàn)，特別是在夜間（圖5B，C）。黑視素拮抗劑對(duì)其趨向性行為的影響如圖5D所示。與對(duì)照組相比，AA92593在100%黑暗條件下發(fā)生了顯著變化，表明黑視素在黑暗環(huán)境中起到了促抑郁的作用，特別是在夜間。同時(shí)，AA92593注射抑制了htr1aa的轉(zhuǎn)錄水平，這表明黑視素可能具有抗抑郁作用（圖5E）。和野生型斑馬魚相比，在注射了aa92593的幼蟲中，BDE-47誘導(dǎo)的變化幅度較溫和。這表明，BDE-47誘導(dǎo)的抑郁最有可能是由于黑視素及其光同步，盡管也可能存在一些其他因素。

圖5 黑視素拮抗劑AA92593顯微注射對(duì)25 μg/L BDE-47暴露的幼魚影響 (A)aanat2 mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果用平均±SEM表示。不同字母的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。(B)斑馬魚幼魚的晝夜節(jié)律活動(dòng)（5?6dpf）。(C)斑馬魚幼魚在夜間（5 dpf）和白天（6 dpf）的總游泳距離。(D)斑馬魚幼魚的趨化性水平。(E) htr1aa mRNA表達(dá)水平。

討論

在本研究中，BDE-47被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致黑視素和相關(guān)的NIF功能在5和6 dpf之間存在明顯的晝夜差異。這種差異被傳遞到SCN中的時(shí)鐘基因和神經(jīng)肽，并影響了鄰近的5-HT和褪黑素受體。然而，抑郁和睡眠等重要因素的變化是單向的，導(dǎo)致BDE-47暴露的幼蟲出現(xiàn)抑郁樣（包括抑郁和嗜睡）效應(yīng)。黑視素拮抗作用提示，這可能主要是由于黑視素的直接光同步功能。

抑郁癥的病因長(zhǎng)期以來(lái)一直爭(zhēng)論，但人們并沒(méi)有達(dá)成共識(shí)?！暗?-HT假說(shuō)”在抑郁癥研究的歷史中具有深遠(yuǎn)的影響，可用于由遺傳、生理和外源性化學(xué)因素促進(jìn)的抑郁癥。最近，NIF視覺(jué)通路，可以被光調(diào)節(jié)，并被環(huán)境化學(xué)物質(zhì)破壞，被提出與抑郁癥中的中樞神經(jīng)遞質(zhì)相協(xié)調(diào)。該途徑利用黑視素發(fā)揮這種影響，依賴于直接光誘導(dǎo)或通過(guò)晝夜節(jié)律間接調(diào)節(jié)，我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)BDE-47聯(lián)合了該機(jī)制（圖6）。中央晝夜節(jié)律依賴于SCN神經(jīng)遞質(zhì)（包括神經(jīng)肽）和時(shí)鐘基因，在BDE-47暴露下被黑視素基因系統(tǒng)地調(diào)節(jié)。時(shí)鐘基因per2和clocka都受到了顯著的影響，但趨勢(shì)相反，表現(xiàn)為夜間減少，白天增加，共同表明時(shí)鐘基因表達(dá)的振蕩增強(qiáng)（圖2A）。5-HT合成酶tph2和下丘腦5-HT水平受到時(shí)鐘基因節(jié)律的同步影響。然而，htr1aa和serta的變化并沒(méi)有表現(xiàn)出這種晝夜節(jié)律上的差異（圖3）。夜間serta和5-HT水平下降提示抑郁癥狀加重，這被BDE-47暴露下較高的夜間趨性所證實(shí)。對(duì)于5-HT1A受體的單調(diào)變化，我們推測(cè)這是因?yàn)闇p少夜間黑視素通過(guò)直接光同步減輕了5-HT受體的抑制，而不干擾晝夜節(jié)律系統(tǒng)，考慮到現(xiàn)有的研究報(bào)告，光在“錯(cuò)誤的”晝夜節(jié)律時(shí)間（例如，夜間）可能誘發(fā)獨(dú)立于硫氰酸鹽的抑郁行為。AA92593的拮抗作用進(jìn)一步證實(shí)了黑視素在直接調(diào)控htr1aa表達(dá)中的重要作用（圖5E)。

睡眠障礙是抑郁癥的核心癥狀，越來(lái)越受到關(guān)注，夜間5-HT缺乏被發(fā)現(xiàn)與睡眠障礙，如睡眠過(guò)度和睡眠質(zhì)量差有關(guān)。褪黑激素現(xiàn)在被認(rèn)為是調(diào)節(jié)睡眠的中心因素，而AANAT是從5- HT中合成褪黑激素的限速酶。對(duì)于斑馬魚，有兩種annta亞型：aanat1僅在視網(wǎng)膜中表達(dá)，而在aanat2循環(huán)，特別是在松果體（高）和視網(wǎng)膜（低）。用BDE-47處理時(shí)，aanat1在夜間顯著增加，而aanat2（AANAT活動(dòng)）的顯著下降與幼蟲運(yùn)動(dòng)的均勻低活動(dòng)狀態(tài)一致。AA92593觸發(fā)了aanat2的表達(dá)增加，與BDE-47的性能相似（圖5A）。這與現(xiàn)有的證據(jù)相一致，即減少黑視素將有利于AANAT的活動(dòng)，特別是在夜間。與此同時(shí)，由于褪黑素主要是在晚上產(chǎn)生的，我們推測(cè)，夜間所有三種opn4黑視素表達(dá)的下降可能是BDE-47暴露后aanat2相關(guān)睡眠異常的主要原因。相反，考慮到野生型和aa92593中注射的相對(duì)微妙的表達(dá)，白天黑視素的影響不那么重要，而褪黑素前體5- HT的增加可能是導(dǎo)致幼蟲活性低下的主要原因。

環(huán)境污染物對(duì)視覺(jué)系統(tǒng)的毒性影響可能在很大程度上被低估了。隨著越來(lái)越多的關(guān)注，許多有機(jī)和無(wú)機(jī)污染物被發(fā)現(xiàn)具有這樣的潛力。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，多溴二苯醚可損害斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞以及視覺(jué)引導(dǎo)行為。然而，與傳統(tǒng)的光感受器（視桿狀體和視錐體）及其圖像形成功能相比，NIF視覺(jué)很少能引起關(guān)注，因?yàn)樗诤艽蟪潭壬先晕幢惶剿?。在目前的研究中，我們?cè)谧C明黑視素的重要性方面取得了進(jìn)展，并發(fā)現(xiàn)它不僅作為斑馬魚視網(wǎng)膜中BDE-47在斑馬魚視網(wǎng)膜中的一個(gè)新的毒性靶點(diǎn)，而且作為破壞NIF通路的初始事件?？紤]到NIF視覺(jué)系統(tǒng)的高度復(fù)雜的原理，研究工作仍在進(jìn)行中。例如，表達(dá)黑視素的ipRGCs也通過(guò)突觸信號(hào)接收來(lái)自桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞的信號(hào)；因此，BDE-47對(duì)黑視素基因的雙向影響可能包含了這些成象光感受器的一些部分。這里所提供的機(jī)制解釋可能需要在未來(lái)隨著不斷加深的理解而加以完善。

總之，我們首次報(bào)道了PBDE暴露下NIF介導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制。BDE-47對(duì)黑視素的影響通過(guò)ipRGC投射改變了大腦不同區(qū)域的時(shí)鐘基因、神經(jīng)遞質(zhì)、激素和代謝酶，并導(dǎo)致了斑馬魚幼蟲的抑郁樣行為。它是一種擴(kuò)展對(duì)于經(jīng)典圖像形成視覺(jué)的工作，表明多溴二苯醚的視覺(jué)損傷可能具有深刻和復(fù)雜的健康影響，包括正如最近的科學(xué)進(jìn)展所聲稱的那樣，人類大腦的各種更高的認(rèn)知和情感功能。在此基礎(chǔ)上，我們的研究為人類抑郁癥與PBDE暴露之間的流行病學(xué)相關(guān)性提供了機(jī)制線索。這種機(jī)制成功地解釋了一些抑郁指標(biāo)的晝夜節(jié)律差異。值得注意的是，在與環(huán)境相關(guān)的BDE-47濃度下，黑視素的神經(jīng)毒性敏感性可能表明其作為水生PBDE暴露生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新靶點(diǎn)的潛在意義。此外，盡管與哺乳動(dòng)物相比，魚類在進(jìn)化上距離人類很遙遠(yuǎn)，但日間斑馬魚模型確實(shí)有它自己的優(yōu)勢(shì)。一旦光感覺(jué)和晝夜節(jié)律被認(rèn)為是人類情緒障礙的危險(xiǎn)因素，小鼠模型的夜間性質(zhì)就不再可以忽略不計(jì)。在小鼠和斑馬魚中保守的毒性機(jī)制對(duì)環(huán)境污染物引起的與視覺(jué)相關(guān)的不良結(jié)果更為可靠。

基金:國(guó)家自然科學(xué)基金（22236006和22076146），上海市科委（22DZ1202400），中央大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基金（22120220584），長(zhǎng)江水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，教育部（同濟(jì)大學(xué)）（YRWEF202106）。

本文章原文：Cao et al. Environ. Sci. Technol. (2023) 57:9592-9602

詳細(xì)網(wǎng)址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.3c01716