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雜志：Journal of Ethnopharmacology  

影響因子：5.4（2022）

年份：2022

通訊作者：E-mail addresses: wangrongchun@163.com (R. Wang)

通訊作者單位：Biology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 28789 East Jingshi Road, Ji’nan, 250103, Shandong Province, PR China.

摘要

背景：天麻(Gastrodia elata白楊)是一種傳統(tǒng)中藥，被稱為“天麻”，在中國被廣泛用作治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用藥物和飲食成分，已有數(shù)千年的歷史。然而，其抗抑郁作用及其機(jī)制尚未得到充分的評(píng)價(jià)。研究目的是采用PC12細(xì)胞模型和斑馬魚模型，分別在體外和體內(nèi)研究龍葵的抗抑郁作用及其分子機(jī)制。

方法：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討白楊提取物(GBE)抗抑郁的潛在有效成分和作用靶點(diǎn)。分別采用MTT法和EdU法測定細(xì)胞活力和增殖能力。采用TUNEL法檢測GBE的抗凋亡作用。免疫熒光法和Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平。此外，采用新穎的水箱潛水試驗(yàn)研究斑馬魚抑郁模型的抗抑郁作用。采用RT-PCR方法分析基因mRNA表達(dá)水平。

結(jié)果：葛根對網(wǎng)狀4受體(RTN4R)和凋亡相關(guān)靶點(diǎn)的抑制作用，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測。此外，GBE可以增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制PC12細(xì)胞對CORT的凋亡。GBE可緩解成年斑馬魚的抑郁樣癥狀，包括增加探索性行為和調(diào)節(jié)抑郁相關(guān)基因。機(jī)制研究表明，GBE抑制rtn4r相關(guān)和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

結(jié)論：我們的研究顯示了桂花對抑郁癥的改善作用。其機(jī)制可能與抑制rtn4r相關(guān)通路和凋亡通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)精神疾?。痪W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；PC12；抗抑郁活性；斑馬魚

前言

抑郁癥是全球最常見的與情緒相關(guān)的嚴(yán)重精神障礙的神經(jīng)精神疾病之一。臨床主要表現(xiàn)為情緒和興趣低落、認(rèn)知功能障礙，甚至有自殺沖動(dòng)，嚴(yán)重影響患者的心理健康。日常生活和工作。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的預(yù)測，全世界各年齡段有超過3億人患有不同程度的抑郁癥，并且抑郁癥的患病率逐年上升。抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制是多因素的，包括生物化學(xué)、遺傳學(xué)、心理社會(huì)因素等。然而，相當(dāng)多的證據(jù)表明，抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化，特別是神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。抑郁癥的主流治療策略包括三環(huán)抗抑郁藥(TCAs)、單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等。然而，盡管TCAs有效，但它也有一些副作用，包括嗜睡、體重增加、胃腸道問題和性功能障礙。因此，迫切需要探索和開發(fā)新的抗抑郁藥，以克服當(dāng)前主流治療的局限性。在這方面，已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，以植物為基礎(chǔ)的療法作為緩解壓力和抑郁的替代療法。此外，據(jù)報(bào)道，植物性療法具有不錯(cuò)的耐受性、低毒性和安全性，這在全球范圍內(nèi)引起了公眾的關(guān)注。

天麻是一種被稱為“天麻”的傳統(tǒng)中草藥，主要分布在中國、東南亞和大洋洲。幾千年來，天麻在中國一直被用作治療或預(yù)防眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用藥和飲食成分。草藥植物對帕金森病、癡呆和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有有益作用。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為一級(jí)中藥材。根據(jù)中國藥典委員會(huì)的報(bào)告，中國的傳統(tǒng)治療師已將elata干燥的根莖用于治療包括頭痛和偏頭痛在內(nèi)的各種中樞神經(jīng)元疾病。elata的主要活性成分包括酚類、醇類、多糖和有機(jī)酸。天麻的次生代謝產(chǎn)物多酚具有抗氧化、抗驚厥、鎮(zhèn)痛和視力調(diào)節(jié)等多種藥理特性。

如今，以基因、蛋白質(zhì)和疾病數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為一個(gè)新興領(lǐng)域，可以從系統(tǒng)的角度揭示復(fù)雜的生物過程和疾病。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以預(yù)測中藥潛在的有效成分及其藥理作用機(jī)制。斑馬魚(Danio rerio)是一個(gè)理想的和有前途的脊椎動(dòng)物模型，在藥理學(xué)，發(fā)育和疾病研究領(lǐng)域由于繁殖率高、器官發(fā)生快、胚胎透明、易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。高度的遺傳保守是一個(gè)額外的優(yōu)勢，它與哺乳動(dòng)物共享相似的基因、蛋白質(zhì)和分子途徑。在神經(jīng)和認(rèn)知研究領(lǐng)域，斑馬魚因其復(fù)雜的大腦結(jié)構(gòu)和神經(jīng)化學(xué)而越來越受歡迎。在精神藥理學(xué)領(lǐng)域，與焦慮、抑郁、情緒障礙和阿爾茨海默病等神經(jīng)疾病相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶變化的分子和行為研究也越來越多。

盡管有一系列的藥理作用，但迄今為止尚無研究報(bào)道其抗抑郁作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了龍葵抗抑郁作用的潛在有效成分。采用PC12細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了天麻的抗抑郁作用。此外，利用斑馬魚模型進(jìn)一步在體內(nèi)評(píng)估其抗抑郁作用及分子機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，揭示了天麻對抑郁癥的改善作用，反映了其作為抗抑郁癥的候選藥物的潛力。

材料及方法

該成分來源于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(TCMSP)，http://tcmspw.com/tcmsp.php)and文獻(xiàn)挖掘。以藥物相似度(DL≥30%)和口服有效度(OB≥0.18)為篩選標(biāo)準(zhǔn)。天牛的指標(biāo)(Norm Fit≥0.7)來自PharmMapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)。

目標(biāo)魚種

通過TTD(Therapeutic Target Database,http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank(http://www.drugbank.ca)、Genecards(http://www.genecards.org)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/home/)和OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man,http://www.omim.org).Depression)發(fā)現(xiàn)并篩選與抑郁癥相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，以抑郁癥或抑郁癥為關(guān)鍵詞。將上述選擇的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中，選擇黃葉草化合物與抑制共有的靶點(diǎn)。然后利用選定的靶蛋白，在String(https://string-db.org/)平臺(tái)上構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。Venn圖由funrichnews.exe在線軟件繪制。

數(shù)據(jù)分析

將選擇的目標(biāo)蛋白信息導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)注、可視化和集成發(fā)現(xiàn)，得到目標(biāo)富集的途徑。選擇官方基因符號(hào)和智人作為背景。P<0.05為篩選條件，排除了廣泛的途徑。

材料

四川天馬的根狀莖由河北大眾醫(yī)藥股份有限公司(20190905)CORT購自USA MCE(No.108718)，利血平購自中國Aladdin(No.108718)。J1817170)。EdU檢測試劑盒購自中國Ribobio公司。牛血清白蛋白(BSA)(CA,Invitrogen);磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、青霉素-鏈霉素(P/S)和0.25%(w/v)胰蛋白酶/1 mM EDTA購自USACA卡爾斯巴德市Invitrogen公司。胎牛血清(FBS)、二甲亞砜(DMSO)、MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]、蛋白酶和膠原蛋白由Sigma(St Louis,MO)提供。一抗(抗gapdh、抗pkc、抗rtn4r、抗s1pr2、抗p65、抗bax和抗caspase3)購自Pro-teintech，中國?？雇肐gG、酶聯(lián)抗體、抗兔IgG(H+L)(Alexa Fluor?488偶聯(lián)物)和DY-554 Phalloidin均購自Cell Signaling Technology(Berverly,MA，USA)。Alexa Fluor 488山羊抗兔和Cy3山羊抗鼠均來自武漢博斯特生物技術(shù)公司(武漢)。HPD100樹脂購自Solarbio(中國北京)。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和SYBR Green系統(tǒng)購自Takara(中國大連)。天麻素的對照品購自ChemFaces(中國武漢)。

天麻的提取方法

G.elata提取物(GBE)采用以下方法得到。簡單地說，用10倍59%乙醇溶液在54℃下提取GBE 89 min。用100 g HPD100樹脂在3.0×25 cm上制備，高度為20 cm。然后以0.15 g/mL的濃度提取100 mL，進(jìn)行柱層析富集。用300 mL 30%乙醇溶液以3 BV/h的流速洗脫GBE。用冷凍干燥機(jī)對GBE進(jìn)行冷凍干燥制備粉末。將干燥后的GBE溶解于蒸餾水中，并在-20?C溫度下保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照2.4.1中的對照品，采用高效液相色譜法測定GBE的含量和成分。

細(xì)胞培養(yǎng)及處理

PC12細(xì)胞在添加10%的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)FBS,100 IU/mL青霉素-鏈霉素(PS)和2.5 ng/mL NGF 37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為以下組，處理24 h:對照組(中劑量)、皮質(zhì)醇(CORT)組(400μM)、低劑量組(CORT+GBE 15μg/mL)、中劑量組(CORT+GBE 15μg/mL)高劑量組(CORT+GBE 45μg/mL)。

動(dòng)物保健

野生型斑馬魚AB系(6個(gè)月大)按照先前描述的標(biāo)準(zhǔn)程序飼養(yǎng)。簡單地說，在一個(gè)自動(dòng)斑馬魚圈養(yǎng)系統(tǒng)(ESEN，北京，中國)中，在14 h/10 h的光/暗周期下，將成魚維持在恒溫(28.5?C))下。魚每天喂食兩次商業(yè)魚食，外加活鹽水蝦。整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用成年斑馬魚，經(jīng)山東省科學(xué)院生物研究所動(dòng)物倫理與福利委員會(huì)(AEWC)批準(zhǔn)。

MTT測定

細(xì)胞活力采用先前報(bào)道的MTT法測定。簡單地說，不同濃度的GBE處理24 h后，在96孔板的每孔中加入10μL MTT(5 mg/mL)。MTT處理4 h后，去除每孔的上清液，在搖床上加入200μL DMSO 10 min。然后用分光光度計(jì)在570 nm處檢測吸光度。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次重復(fù)。采用0、15、30、45、60、75、90μg/mL GBE單獨(dú)作用，研究GBE單獨(dú)作用對PC12細(xì)胞的影響。

EdU測定

EdU法研究了GBE對PC12增殖的影響。簡單地說，將5個(gè)×10-4細(xì)胞/孔板接到96孔中。不同劑量GBE孵育24 h后，50μM EdU孵育2 h,4%PFA固定20 min,0.5%Triton X-100浸透10 min,Apollo反應(yīng)液孵育30 min,Hoechst33342染色20 min，熒光顯微鏡下觀察。通過EdU染色細(xì)胞與Hoechst33342染色細(xì)胞的比值計(jì)算增殖率。

細(xì)胞凋亡測定

根據(jù)前期報(bào)道的研究，采用TUNEL方法評(píng)估GBE對PC12細(xì)胞的抗凋亡作用。簡單地說，GBE處理24 h的PC12細(xì)胞用PBS沖洗，然后在4%PFA中固定20分鐘。然后用PBS洗滌兩次，用0.1%Triton X-100在PBS中滲透5min。PBS洗滌2次后，使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，試劑盒使用說明書(Beyotime,Shanghai,China)。在488和512 nm/發(fā)射光激發(fā)下的熒光顯微鏡下進(jìn)行顯微鏡觀察(ZEISS LSM 510 META，德國)。以FITC染色的凋亡細(xì)胞數(shù)與DAPI染色的總細(xì)胞數(shù)之比測定細(xì)胞凋亡率。

免疫熒光

I免疫熒光法參照以往報(bào)道。簡單地說，GBE處理24小時(shí)后，PC12細(xì)胞用PBS沖洗，用4%PFA固定，用0.1%檸檬酸鈉/0.1%Triton X-100在PBS中滲透，用5%牛血清白蛋白阻斷。然后用一抗(小鼠抗caspase3 1:20 00，兔抗bax 1:50 00(Proteintech,China)4?C)孵育細(xì)胞過夜。用Alexa Fluor 488山羊抗兔和Cy3山羊抗小鼠標(biāo)記的二抗(1:200)孵育后，用DAPI染色10分鐘，然后在蔡司LSM 510共聚焦顯微鏡下觀察。

免疫印跡

用GBE處理后，按照先前的報(bào)告進(jìn)行蛋白分離和western blotting。簡單地說，將細(xì)胞在含有0.1%PMSF的RIPA裂解緩沖液中裂解，并用BCA測定試劑盒(Boster，CA，USA)測定蛋白質(zhì)含量。然后等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳在TBST中阻斷后，用抗gapdh、抗pkc、抗rtn4r、抗s1pr2、抗p65、抗bax、抗caspase3等一抗按1:50 000的比例孵育。然后用HRP偶聯(lián)的二抗孵育后，用ECL高級(jí)Western blotting檢測試劑盒顯示蛋白條帶，并用ImageJ(Maryland，USA)定量檢測相對蛋白水平。以GAPDH作為內(nèi)控。

新奇水箱試驗(yàn)

如前所述，斑馬魚的抑郁狀態(tài)通過新穎的水箱潛水測試進(jìn)行評(píng)估。在1L水中，用20mg/L利血平治療成年斑馬魚，不論男女，持續(xù)20分鐘。然后將魚單獨(dú)暴露于養(yǎng)殖水或GBE組(25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L)。暴露液每天更換，有助于保持恒定的濃度。此外，將成魚與活鹽水蝦一起轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)池中喂養(yǎng)。各組均連續(xù)飼喂7 d。在行為測試之前，斑馬魚在水箱中習(xí)慣2分鐘。然后使用視頻跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行3分鐘的視頻記錄。每組8條斑馬魚尾進(jìn)行行為測試。之后分別用濃度為100和120 mg/L的GBE單獨(dú)給藥組進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)治療7天。使用Zebralab(Viewpoint，里昂，法國)分析數(shù)據(jù)，包括總持續(xù)時(shí)間(s)、數(shù)量、頂部總游泳距離(m)和到達(dá)頂部的延遲時(shí)間(s)。

實(shí)時(shí)定量PCR

行為測定后，先用三卡因(0.16%)麻醉魚。然后立即在冰上斬首處死。然后在試管中收集魚的腦組織，并在?80?C下快速保存以分離總RNA。組織在粉碎機(jī)中勻漿，用TRIzol試劑提取。以O(shè)D260/OD280比值評(píng)價(jià)提取的RNA質(zhì)量。然后用PrimeScript?RT Master Mix(Takara，東京，日本)進(jìn)行cDNA合成。采用SYBR綠色標(biāo)記系統(tǒng)(Takara，大連，中國)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以Rpl13a為內(nèi)控，一式三次。引物序列見補(bǔ)充資料(表S1)。

統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software;CA，USA)，表示為平均值±SEM。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié)果

黃菖蒲的主要活性成分及其作用靶點(diǎn)

如表1所示，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了8種多酚。從PharmMappe r、SEA和STITCH數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了這8種G.elata合物中的125個(gè)靶點(diǎn)(評(píng)分>0.7)(圖1A)。

表1 elata多酚有效成分表

黃芪與抑郁癥共同的潛在靶點(diǎn)

從TTD、Drugbank、Genecards、DisGeNET和OMIM數(shù)據(jù)庫中共篩選出1235個(gè)與抑郁癥相關(guān)的靶點(diǎn)(圖1)。使用UniProt對這些靶點(diǎn)進(jìn)行鑒定，去除重復(fù)，并與葛蘭活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)進(jìn)行交叉。結(jié)果，我們篩選出了15個(gè)與抑郁有共同交集的靶點(diǎn)(圖1和表2)。利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建了草藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。如圖1B所示，共有23個(gè)節(jié)點(diǎn)分別代表8種G.elata成分(方形節(jié)點(diǎn))和15個(gè)共享目標(biāo)(v形節(jié)點(diǎn))。這63條邊表示了目標(biāo)與大葉藻之間的關(guān)系。

GO通路分析

為了準(zhǔn)確了解這些靶標(biāo)的功能，我們使用DAVID在線分析對靶基因進(jìn)行功能富集分析。其中，GO項(xiàng)(P<0.001)顯示，靶標(biāo)主要與以下項(xiàng)目相關(guān):類固醇激素應(yīng)答、外部刺激應(yīng)答負(fù)調(diào)控、atp酶結(jié)合、酰胺結(jié)合、氧化還原酶活性、水解酶活性、作用于酯鍵、有機(jī)羥基化合物生物合成過程、有機(jī)磷酸酯分解代謝過程、小分子分解代謝過程和碳水化合物代謝過程(表3)。

GBE對cort處理的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用

中藥的生物活性主要取決于其有效成分。先前的報(bào)道表明，天麻素、4-羥基芐基醇、香蘭醇、4-羥基苯甲醛和香蘭素是治療或預(yù)防多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要活性化合物。在這里，G.elata的提取物獲得并用于進(jìn)一步的體內(nèi)和體外研究。HPLC結(jié)果顯示，天麻素為對照品，含量為20.49 mg/g(數(shù)據(jù)未顯示)。先前的報(bào)告顯示，與對照組相比，73%的抑郁癥患者CORT值升高，CORT水平與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。根據(jù)之前的報(bào)道，我們使用400μM CORT體外生成模型。MTT法檢測GBE對PC12細(xì)胞活力的影響。如圖2所示，與對照組相比，CORT組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.001)。然而，與CORT組相比，GBE治療組在30μg/mL(P<0.01)和45μg/mL(P<0.001)時(shí)顯著增加。進(jìn)一步評(píng)估GBE單獨(dú)作用對PC12細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，90μg/mL濃度下GBE對PC12細(xì)胞無促增殖作用(P>0.05)(圖S2)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CORT存在的情況下，45μg/mL濃度下GBE的促增殖作用無顯著差異(P>0.05)，而CORT能顯著抑制PC12細(xì)胞的增殖(P<0.001)(圖S3)。這些結(jié)果表明，GBE對CORT誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。

圖2所示 GBE對CORT細(xì)胞活力的保護(hù)作用。采用MTT法測定GBE(15、30、45μg/mL)加或不加400μM CORT處理PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力。對照組僅用培養(yǎng)基處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±SEM表示。***P<0.0 01 vs Control;##P<0.01，##P<0.001vsCORT。

GBE抑制CORT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

既往研究表明，CORT可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因此，我們采用TUNEL方法評(píng)估GBE的抗凋亡作用。與CORT組相比，GBE組具有紅色熒光信號(hào)的凋亡細(xì)胞明顯減少(圖3A)。如圖3B所示，與cort處理組相比，15μg/mL GBE處理組(P<0.05)、30μg/mL GBE處理組(P<0.01)和45μg/mL GBE處理組(P<0.001)的細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性降低。這些結(jié)果表明，GBE通過抑制CORT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來保護(hù)PC12細(xì)胞。

圖3所示。GBE對CORT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。(A)TUNEL染色的代表性圖像。(B)TUNEL染色定量分析。***P<0.001 vs對照組;#P<0.0 5，##P<0.01，###P<0.0 01 vs CORT。原始放大倍數(shù)，×200和×400。比例尺:100μm。

GBE抑制CORT誘導(dǎo)的RTN4R、S1PR2、PKC、P65的表達(dá)

通過測定RTN4R、S1PR2、PKC和P65的蛋白表達(dá)水平，揭示GBE抗抑郁作用背后的潛在分子機(jī)制。與對照組相比，CORT組中RTN4R(P<0.001)、S1PR2(P<0.001)、PKC(P<0.001)和P65(P<0.001)的表達(dá)顯著增加(圖5B-E)。相反，15μg/mL GBE(P<0.001)、30μg/mL GBE(P<0.001)和45μg/mL GBE(P<0.001)分別顯著降低了RTN4R、PKC和P65的表達(dá)(圖5B,D-E)。此外，15μg/mL GBE(P<0.01)、30μg/mL GBE(P<0.001)和45μg/mL GBE(P<0.001)處理后，S1PR2的表達(dá)水平顯著下降(圖5C)。

圖5所示。GBE對蛋白表達(dá)的影響。(A)綜合W RTN4R、S1PR2、PKC和P65的western blot圖像。(B-E)RTN4R、S1PR2、PKC和P65的定量分析。將蛋白水平歸一化為GAPDH。***P<0.001 vs對照組;##P<0.0 1，##P<0.001 v s CORT。

成年斑馬魚的行為測試

以前的報(bào)道表明利血平是一種囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(VMAT)抑制劑，通過阻斷VMAT產(chǎn)生病理作用。長期使用此類藥物可能會(huì)導(dǎo)致抑郁癥。為了評(píng)估GBE在體內(nèi)的抗抑郁作用，采用斑馬魚模型進(jìn)行了新型的水箱試驗(yàn)。如圖6所示，與對照組相比，利血平組在水箱頂部游動(dòng)軌跡的探索性行為顯著減少(P<0.001)。然而，與利血平組相比，GBE在25 mg/L(P<0.001)、50 mg/L(P<0.05)和100 mg/L(P<0.05)的濃度下，增加了斑馬魚在水箱上部區(qū)域停留的時(shí)間和行走的距離(圖6B和C)。與利血平濃度為25 mg/L(P<0.001)、50 mg/L(P<0.01)和100 mg/L(P<0.01)的濃度組相比，GBE處理后斑馬魚首次到達(dá)頂部的時(shí)間顯著縮短(圖6D和E)。25 mg/L(P<0.01)和50 mg/L(P<0.05)時(shí)，GBE增加了斑馬魚頂部和底部之間的數(shù)量(圖6F和G)。值得一提的是，GBE在斑馬魚模型中的抗抑郁作用不依賴于濃度。我們還發(fā)現(xiàn)，連續(xù)7天單獨(dú)用GBE(120 mg/L)處理的斑馬魚在水箱上部區(qū)域停留的時(shí)間、行走的距離和穿梭的次數(shù)減少(P<0.05)，而濃度為100 mg/L的斑馬魚沒有顯著差異(P>0.05)(圖S4)。我們的結(jié)果表明，GBE在體內(nèi)具有抗抑郁作用，這與體外研究結(jié)果一致。

圖6所示。GBE對成年斑馬魚抑郁樣行為的緩解作用。(A)新型水箱潛水試驗(yàn)中具有代表性的游泳軌跡。(B-C)斑馬魚的游泳距離和斑馬魚的游泳時(shí)間在上面。(D-E)斑馬魚第一次到達(dá)頂部的時(shí)間。(F-G)斑馬魚在頂部和底部之間穿梭的次數(shù)。***P<0.001vs Control;#P<0.05，###P<0.001vs利血平。

GBE治療后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

研究了與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因(mao,vmat2,prl,pomc,hcrt和mr)，以準(zhǔn)確地了解GBE在斑馬魚中的抗抑郁作用背后的機(jī)制。與對照組相比，利血平組mao(P<0.001)、vmat2(P<0.001)、prl(P<0.05)的表達(dá)均顯著下調(diào)(圖7A-C)。這些下調(diào)的表達(dá)在不同濃度的GBE處理后依次增加(圖7A-C)。與對照組和gbe治療組相比，利血平組mr的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7D)。然而，與對照組相比，利血平組hcrt(P<0.001)和pomc(P<0.001)的mRNA水平顯著上調(diào)(圖7E和F)。具體而言，在25 mg/L GBE(P<0.001)、50 mg/L GBE(P<0.001)和100 mg/L GBE(P<0.001)治療時(shí)，hcrt和pomc的表達(dá)顯著降低(圖7E和F)。利血平治療GBE后抑郁相關(guān)基因(mao、vmat2、prl、mr、hcrt和pomc)的mRNA水平。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。*P<0.05，***P<0.001 vs Control;#P<0.05，##P<0.0 1，##P<0.001 vs利血平。圖7所示。GBE對抑郁癥相關(guān)基因表達(dá)的影響。

討論

抑郁癥是一種常見的精神疾病，似乎是由于大腦和脊髓中神經(jīng)元和突觸的喪失而引起的，其特點(diǎn)是死亡率和發(fā)病率高。缺乏針對抑郁癥的有效治療方法，主流抗抑郁療法存在副作用、療效低等問題。龍葵是一種具有多種藥理作用的中藥，包括抗驚厥作用、神經(jīng)保護(hù)作用、對腦動(dòng)脈閉塞的保護(hù)作用，對記憶的改善作用。多酚，如天麻素是天麻中重要的活性成分，具有高安全性和低毒性。盡管有大量的藥理作用，但其對抑郁癥的保護(hù)作用及其相關(guān)的潛在機(jī)制尚未完全了解。

在此，我們利用多種方法來闡明苦參的抗抑郁作用。正是利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討了桂花抗抑郁的潛在作用和活性靶點(diǎn)。此外，采用PC12細(xì)胞模型和斑馬魚模型，分別研究了白樺的體內(nèi)和體外抗抑郁作用及其機(jī)制。CORT是一種由人類腎上腺分泌的激素，與抑郁癥有關(guān)。抑郁癥患者通常會(huì)產(chǎn)生過量的CORT。在我們目前的研究中，CORT用于體外誘導(dǎo)抑郁。結(jié)果表明，GBE對CORT所致抑郁具有保護(hù)作用。先前的研究結(jié)果表明，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)由于慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，發(fā)生了變化甚至神經(jīng)元凋亡。在我們的研究中，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CORT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)Caspase 3和Bax的表達(dá)，而GBE抑制活化的細(xì)胞凋亡。Bax和Caspase3作為促凋亡的關(guān)鍵蛋白，是細(xì)胞凋亡激活和執(zhí)行的重要標(biāo)志。

基于上述結(jié)果，我們認(rèn)為，天麻對抑郁癥的新保護(hù)作用可能與其抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。炎癥介質(zhì)激活NF-κB后，NF-κB p65亞基易位入核，調(diào)控多種基因的表達(dá)，包括促炎細(xì)胞因子和促凋亡相關(guān)基因。我們的研究結(jié)果表明，GBE處理顯著抑制了CORT誘導(dǎo)的NF-κB p65的活化。根據(jù)我們的研究結(jié)果，我們可以推測GBE抑制了炎癥反應(yīng)，這可能是由CORT誘導(dǎo)的，然后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過程的進(jìn)一步抑制。Nogo受體(NgR)，由RTN4R基因編碼，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和海馬神經(jīng)元細(xì)胞的再生、發(fā)芽和可塑性，在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元連通性的完善過程中發(fā)揮重要作用。因此，rtn4r相關(guān)信號(hào)可能在成年期和成長期穩(wěn)定大腦線路，并可能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。RTN4R的失調(diào)與認(rèn)知和行為障礙有關(guān)，包括工作記憶受損和學(xué)習(xí)能力下降。RTN4R通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出來。因此，我們進(jìn)一步檢測了RTN4R的蛋白水平。結(jié)果表明，GBE治療后，CORT增加的RTN4R表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)。S1PR2通過激活PKC通路的表達(dá)調(diào)控多種神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、存活和遷移。S1PR2還能抑制NF-κB信號(hào)通路，減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。我們的研究結(jié)果表明，RTN4R、PKC、S1PR2和NF-κB p65的抑制表達(dá)與GBE對抑郁癥的保護(hù)作用有關(guān)。神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能損傷可能進(jìn)一步加劇導(dǎo)致抑郁相關(guān)行為。

在本研究中，我們采用新穎的水箱實(shí)驗(yàn)來評(píng)估GBE治療對利血平誘導(dǎo)的斑馬魚抑郁的保護(hù)作用。根據(jù)探索和運(yùn)動(dòng)行為對斑馬魚的抑郁指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。正如之前報(bào)道的那樣，在治療7天后，利血平誘導(dǎo)了成年斑馬魚的抑郁樣行為。行走的總距離和探索行為(包括花費(fèi)的時(shí)間、在頂部行走的距離、到達(dá)頂部的潛伏期等)被利血平顯著降低，而凍結(jié)行為(凍結(jié)次數(shù)和持續(xù)時(shí)間)顯著增加。與利血平組相比，gbe治療組表現(xiàn)出減輕的行為模式。結(jié)果表明，GBE能抑制斑馬魚的抑郁行為。為了精確地說明潛在的分子機(jī)制，參與合成或降解5-羥色胺等的基因RT-PCR檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。Vmat2(vesicular monoamine transporter 2)可以運(yùn)輸單胺重要的信號(hào)分子，由多巴胺，血清素，和去甲腎上腺素。Vmat2也保護(hù)單胺不被氧化單胺氧化酶和兒茶酚正甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)。我們的研究結(jié)果利血平抑制mao、prl、vmat2的表達(dá);而GBE治療逆轉(zhuǎn)了這種下降。Vmat2抑制劑減少多巴胺神經(jīng)傳遞和消耗單胺，如多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和組胺。先前的報(bào)道表明，促黑素皮質(zhì)素(pomc)基因的失調(diào)與抑郁癥。鹽皮質(zhì)激素受體(mr)調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶所需的神經(jīng)元變化，它們密集分布在海馬體區(qū)域。激素催乳素(prl)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和情緒應(yīng)激反應(yīng)，并與抑郁癥有關(guān)。這些結(jié)果表明，調(diào)控神經(jīng)功能關(guān)鍵基因參與抗抑郁活性對的GBE。

結(jié)論

綜上所述，抗抑郁的潛在成分和靶點(diǎn)從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)上可以明顯看出。此外，GBE改善了抑郁樣癥狀，包括斑馬魚抑郁模型中探索性行為的增加和抑郁相關(guān)基因的調(diào)節(jié)。GBE對抑郁癥的改善作用可能與抑制rtn4r相關(guān)通路和凋亡通路有關(guān)。我們的研究結(jié)果增加了目前對白樺抗抑郁作用的理解，并揭示了其假定的潛在機(jī)制。

基金：濟(jì)南市高校人才工程(No.2021GXRC106、2021GXRC111)和“一帶一路”創(chuàng)新外國專家工程(No.2021GXRC111)資助。DL2021023004 L)。同時(shí)，我們也感謝山東省高端外國專家引進(jìn)計(jì)劃(No.6)的資助。項(xiàng)目編號(hào):WST2019006、WST2020008。

本文章原文：Journal of Ethnopharmacology 289(2022)115018

詳細(xì)地址：https://doi.org/10.1016/j.jep.2022.115018