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文獻(xiàn)解析 | 聚苯乙烯微塑料通過(guò)ros介導(dǎo)的p53信號(hào)通路誘導(dǎo)斑馬魚(yú)細(xì)胞凋亡

來(lái)源:https://doi.org/10.1016/j.cbi.2021.109550 | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2023-09-09 | 1020 次瀏覽 | 分享到:

背景：微塑料(MP)污染普遍存在，已成為水生生物的威脅。最近的科學(xué)報(bào)告記錄了它們?cè)诩?xì)胞和生物水平上的毒性影響，但其毒性的潛在分子機(jī)制仍不清楚。

雜志：CHEMICO-BIOLOGICAL INTERACTIONS

影響因子：5.1（2022）

年份：2021

通訊作者：M. Ramesh

通訊作者單位：印度bharathar大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)系毒理學(xué)研究室，印度泰米爾納德邦哥印拜陀641 046

摘要

方法：不同濃度(10和100μgL?1))的PS-MPs誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而影響氧化和免疫防御機(jī)制。抗氧化基因cat、sod1、gpx1a和gstp1的表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變。PS-MPs還能顯著抑制斑馬魚(yú)的神經(jīng)傳遞。此外，PS-MPs暴露可上調(diào)p53、gadd45ba和casp3b的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

結(jié)果：我們證明PS-MPs顯著上調(diào)tnfa和ptgs2a的轉(zhuǎn)錄模式，這是炎癥機(jī)制中必不可少的基因標(biāo)記。此外，PS-MPs暴露誘導(dǎo)的氧化損傷可導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)損傷，導(dǎo)致片層結(jié)構(gòu)改變、毛細(xì)血管擴(kuò)張和鰓組織壞死。

結(jié)論：總之，本研究結(jié)果強(qiáng)烈提示PS-MPs可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性ROS介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。此外，在鰓中觀察到的生理反應(yīng)與上述觀察結(jié)果相關(guān)，有助于揭示斑馬魚(yú)PS-MPs毒性的潛在分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞：PS-MPs；斑馬魚(yú)；ROS；p53信號(hào)通路

前言

全球范圍內(nèi)塑料制造和處理的增加導(dǎo)致了水體中塑料碎片的釋放，從而給今世后代帶來(lái)了生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)確定，每年進(jìn)入海水的塑料垃圾為400-1200萬(wàn)噸。大部分塑料垃圾以較大的塑料和碎片的形式在海洋環(huán)境中循環(huán)，是不可生物降解的，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的影響。此外，在環(huán)境中，塑料受到降解，從而形成微塑料。Klein等報(bào)道，塑料在環(huán)境中的降解可能是形成微塑料的關(guān)鍵因素。此外，通過(guò)光氧化、熱氧化反應(yīng)和微生物降解MPs可能導(dǎo)致納米塑料等較小顆粒的破碎，這已被認(rèn)為是對(duì)水生生物的嚴(yán)重威脅。塑料還可能作為其他環(huán)境污染物的載體，并影響其毒性。日常生活中使用的常見(jiàn)塑料包括高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚酰胺(PA)、聚酯(PES)、聚氯乙烯(PVC)和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)。在這些塑料中，PS在海洋環(huán)境中被頻繁識(shí)別的塑料碎片類(lèi)別中排名第三。商業(yè)研究和咨詢(xún)報(bào)告稱(chēng)，全球生產(chǎn)的PS約為3270萬(wàn)噸。PS是由苯乙烯單體聚合而成的芳香烴。PS除作為通用塑料外，還廣泛應(yīng)用于生物分析和生物醫(yī)學(xué)平臺(tái)。研究還報(bào)道苯乙烯單體從PS容器遷移到食品中對(duì)人類(lèi)構(gòu)成威脅。同時(shí)，PS微珠、顆?；蚧瘖y品、洗滌劑和紡織品的碎片也會(huì)滲入水生環(huán)境。

聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)是其中最豐富的一種海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的MPs。這些持續(xù)的PS-MPs在水生環(huán)境中對(duì)生物產(chǎn)生有害的后果海洋生命，與人類(lèi)健康息息相關(guān)。這是由于它們的構(gòu)象，具有毒物吸附能力、生物轉(zhuǎn)化和生物放大能力在食物鏈中。不幸的是，大多數(shù)議員和np人們食用的食物都是用聚苯乙烯容器包裝的，海產(chǎn)品和PS-MPs/PS-NPs不可測(cè)的水。海產(chǎn)品的主要來(lái)源是富含魚(yú)類(lèi)和貝殼類(lèi)蛋白質(zhì)含量。大約20%的單個(gè)貝類(lèi)魚(yú)類(lèi)的胃腸道中裝載著微塑料垃圾大片。PS-MPs在魚(yú)類(lèi)中的攝入和毒性已被證實(shí)包括氧化損傷，神經(jīng)毒性，基因表達(dá)，葡萄糖代謝改變斑馬魚(yú)胚胎的Bolism，斑馬魚(yú)的行為反應(yīng)幼蟲(chóng)，幼年大水蚤的死亡率，下降魚(yú)和腸道免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)率和總能量功能障礙?，F(xiàn)有的PS-MPs毒性研究提供了數(shù)據(jù)生理水平上，PS-MPs是否具有毒性仍是假設(shè)其作用是ROS依賴(lài)的，并影響分子通路產(chǎn)生有害影響。

在正常的生理?xiàng)l件下，兩者之間是有平衡的活性氧生成和抗氧化活性。MPs暴露可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化增加的產(chǎn)生。作為對(duì)氧化應(yīng)激的一種代償反應(yīng)，抗氧化劑是由活細(xì)胞產(chǎn)生。之前的研究表明，這種活動(dòng)抗氧化劑的產(chǎn)生受ROS誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡速度的影響保護(hù)性基因轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)ROS生成腫瘤壞死因子(tnf)是一種促炎細(xì)胞因子相互依賴(lài)，因?yàn)橐粋€(gè)的產(chǎn)生會(huì)觸發(fā)另一個(gè)的激活。

ROS在多種信號(hào)通路中起關(guān)鍵啟動(dòng)作用參與細(xì)胞周期和能量代謝。強(qiáng)和程已報(bào)道ROS介導(dǎo)的p53凋亡級(jí)聯(lián)激活在接觸微塑料。p53信號(hào)通路調(diào)節(jié)多種多樣與細(xì)胞周期、衰老、細(xì)胞存活相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡。p53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激信號(hào)凋亡通過(guò)cas3b和gadd45ba激活斑馬魚(yú)中炎癥生物標(biāo)志物ptgs2a的表達(dá)的基因gadd45ba與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)任何化學(xué)或環(huán)境壓力，導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯，DNA損傷或細(xì)胞凋亡。有限數(shù)量的毒性研究表明氧化和隨后的DNA損傷與生理有關(guān)PS-MPs誘導(dǎo)的反應(yīng)。

然而，PS-MPs誘導(dǎo)毒性的潛在機(jī)制是還不清楚。本研究旨在進(jìn)一步探討辨別這些機(jī)制，誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)及其相關(guān)斑馬魚(yú)的凋亡途徑。斑馬魚(yú)(Danio rerio)已經(jīng)廣泛存在用作脊椎動(dòng)物模型，用于研究任何化學(xué)物質(zhì)的毒性水生環(huán)境。除了脊椎動(dòng)物模型，它是成功的模型在議員毒性研究透明自然本土化熒光MPs/NPs。我們假設(shè)ROS介導(dǎo)p53凋亡通路通過(guò)casp3b激活并隨之調(diào)節(jié)PS-MPs暴露后斑馬魚(yú)的生理變化。在目前的研究中,我們?cè)u(píng)估了PS-MPs誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的潛力，斑馬魚(yú)(Danio rerio)的生化和組織學(xué)反應(yīng)。在此外，我們探索了PS-MPs對(duì)轉(zhuǎn)錄模式的影響基因參與凋亡通路和炎癥反應(yīng)斑馬魚(yú)的鰓。

方法與試劑

聚苯乙烯

粒徑為0.10-0.12μm的PS-MP微球(產(chǎn)品號(hào):LB1)從Sigma Aldrich買(mǎi)的水懸浮液。的形態(tài)用掃描電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行表征(SEM-FEI QUANTA 200)，其中滴聲微粒懸浮液被置于雙面膠上的碳帶固定在一個(gè)鋁存根。在無(wú)菌環(huán)境中風(fēng)干，涂上涂層在低真空模式(電壓-15 kV;工作距離-10毫米)。PS-MP微珠的功能特性用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析(FTIR-4100型A)。用于測(cè)量PS-MP珠的尺寸，20μL的取懸浮液，用Zetasizer Nano進(jìn)行分析，英國(guó)馬爾文，散射角90?波長(zhǎng)633 nm。

化學(xué)物質(zhì)

堿性磷酸酶(AKP)和乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自印度果阿的Coral臨床系統(tǒng)公司。高------容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR預(yù)混物Ex Taq TM II購(gòu)自Thermofisher Scientific和Takara respec-有效。本研究使用的引物購(gòu)自Euroflims基因組學(xué)。TRI試劑購(gòu)自Sigma Aldrich公司。其他的化學(xué)品購(gòu)自印度HiMedia Laboratories Pvt.Ltd.。

斑馬魚(yú)和暴露

在本研究中，所有實(shí)驗(yàn)均按經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織的規(guī)定和實(shí)驗(yàn)的控制和監(jiān)督委員會(huì)動(dòng)物(CPCSEA)。成年雄性斑馬魚(yú)(AB株)取自新金色水族館，Coimbatore，并保持在充氣淡水。水的理化參數(shù)，即溫度26.4±1.2?C,pH 6.6±0.53，總硬度159±2.7 mg L?1 CaCO3，堿度194±2.04 mg L?1，溶解氧6.8±0.3 mg L?1每天按照APHA指南進(jìn)行測(cè)量。acclimatiza-當(dāng)時(shí)，這些魚(yú)用商業(yè)顆粒喂養(yǎng)，水是每天更新一次。

兩種不同濃度的PS-MPs即10μg L?1和100μg L?1以μg L?1檢測(cè)的慢性毒性。健康的魚(yú)體質(zhì)量(0.28±0.07)g，身長(zhǎng)(2.43±0.06)cm Nos)從庫(kù)存中選擇并引入每個(gè)玻璃水族箱中裝滿(mǎn)35升水。魚(yú)類(lèi)暴露在兩種濃度的PS-MPs(10μg L?1作為處理I,100μg L?1作為處理II)每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)對(duì)照。玻璃淡水水族館是補(bǔ)充測(cè)試解決方案(控制)每24 h給藥1次，維持PS-MPs濃度。每天的理療測(cè)定了水的化學(xué)性質(zhì)chromium的水。用7進(jìn)行為期35天的實(shí)驗(yàn)日采樣頻率。暴露后，對(duì)照組和處理組采樣，用甲醇清洗去除來(lái)自皮膚的顆粒，重量分別為(0.28±0.09)g和(2.55±0.09)g體長(zhǎng)0.08 cm)，麻醉后切取鰓組織用于生化測(cè)定。同樣,從每個(gè)4魚(yú)類(lèi)的鰓水族缸分別于第7、35天末取材，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察邏輯分析(1例)和表達(dá)分析(3例)。

樣品勻漿的制備

將混合后的組織樣本用冷磷勻漿處理磷酸鹽緩沖液(50 mM,pH 7.4)。用勻漿的一部分用于脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)檢測(cè)。剩下的homge-在12000 g下在4℃下離心30 min并且使上清液測(cè)定活性氧(ROS)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和生化酶酶(AKP和LDH)。

活性氧(ROS)

ROS水平被修改后的二氯熒光素-測(cè)量二乙酸鹽(DCF-DA)法;20毫升上清液，200毫升的PBS和8.3毫升DCF-DA補(bǔ)充道,在黑暗中孵化在37℃下持續(xù)30分鐘。用485檢測(cè)熒光強(qiáng)度勵(lì)磁和520 nm發(fā)射熒光分光計(jì)(HORIVA)，用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)

在硫代巴比妥酸反應(yīng)后估計(jì)LPO水平物質(zhì)(TBARS)測(cè)定。很快，100毫升5%三氯乙酸酸(檸檬酸)添加到組織勻漿和孵化4?C然后將100 mL 0.67%硫代巴比妥酸添加到在2200 g下離心10 min。得到清晰的上層相在熱水浴中孵育10分鐘，冷卻后取光密度微型板塊光度計(jì)測(cè)量在535 nm(協(xié)同H1,BioTek)。

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性

采用Sinha法測(cè)定CAT活性略有修改。簡(jiǎn)單地說(shuō)，25μL冰冷的Tris-HCl緩沖液(100 mM,pH 7.4)加入組織勻漿并冷卻12000 g離心15 min，收集清晰的上層相，3 mL反應(yīng)混合物(乙酸與5%重鉻酸鉀)以3:1的比例加入10 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)在熱水浴中孵育15 min在570 nm下在微孔板中測(cè)量溶液密度光度計(jì)。

超氧化物歧化酶(SOD)的活性

采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定SOD活性Marklund和Marklund[61]，稍加修改。100的25μL mM Tris-HCl緩沖區(qū)(pH值7.4)被添加到組織勻漿和12000 g冷離心15分鐘，收集清晰的上層相添加到反應(yīng)溶液(50 mM Tris-HCl緩沖液，含1 mM EDTA和2.64 mM鄰苯三酚)，在420處讀取光密度值納米在微孔板光度計(jì)。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性

采用Domingues采用的方法測(cè)定GST水平等，稍加修改。大約25μL組織勻漿中加入Tris-HCl緩沖液(100 mM,pH 7.4)12000 g冷離心15 min，上層相清晰離心后得到的。然后，880μL的反應(yīng)混合物(1 mM GSH,150 mM NADPH,100 mM鉀疊氮化鈉磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)，吸光度為在340 nm下測(cè)量1分鐘的光度。

谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶(GST)活性

采用Domingues采用的方法測(cè)定GST水平稍加修改?？傊?100μL的反應(yīng)溶液(10 mM GSH和60 mM 1-氯o2,4-二硝基苯)加入50μL的清上清液，其光密度為在340 nm的微孔板光度計(jì)中測(cè)量5分鐘。

生物化學(xué)分析

采用Reagent法測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)和乳酸脫氫酶(LDH)活性遵循制造商規(guī)程的試劑盒。

乙酰膽堿酯酶(AChE)活性疼痛級(jí)別

使用改編的方法測(cè)量了Ellman et al。稍加修改，很快，250μL的反應(yīng)溶液(30 mL 0.1 M磷酸鹽緩沖液，1 mL 10 mM 5,5-二硫代-2-硝基-苯甲酸溶液中加入碳酸氫鈉，并加入0.2 mL 0.075 M乙酰膽堿溶液)加入50μL的上清液中用微孔板光度計(jì)在414 nm下測(cè)量光密度。

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

為了研究表達(dá)模式，我們提取了總RNA使用TRI試劑進(jìn)行鰓組織樣本的混合制作的協(xié)議。獲得的RNA純度和數(shù)量均為使用NanoDrop平板閱讀器(NanoDrop Technologies，協(xié)同作用)?？俁NA(1μg/μL)每個(gè)樣本的反向轉(zhuǎn)錄使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。定量的真實(shí),采用SYBR Premix Ex Taq合成cdna進(jìn)行時(shí)間PCR TM II和lightcycler 480(羅氏)中的基因特異性引物。re-動(dòng)作涉及變性(在95?C 10分鐘)，放大(40循環(huán)在95?C為15 s和在60?C為1分鐘)，隨后定量陽(yáng)離子,融化曲線(xiàn)程序(60-99?C)。源和se-所用引物序列如表1所示。所有PCR反應(yīng)均為重復(fù)3次，β-actin被用于標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)基因表達(dá)曲線(xiàn)?；蛳鄬?duì)倍數(shù)變化使用2?ΔΔCT方法確定。組織學(xué)分析

應(yīng)用熒光顯微鏡對(duì)斑馬魚(yú)鰓進(jìn)行組織學(xué)分析Teng等。鰓組織在10%福爾馬林固定持續(xù)48小時(shí)，并在不斷增加的乙醇串中經(jīng)受脫水。然后用二甲苯清除組織，包埋在石蠟塊中蠟，并以3-5μm厚度切片。切片組織為蘇木精和伊紅染色(圓))進(jìn)行微觀分析。的幻燈片使用光學(xué)顯微鏡觀察和拍攝(測(cè)距裝置光學(xué)顯微鏡,徠卡)。

統(tǒng)計(jì)分析

使用Graph Pad Prism軟件(第8版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析。采用雙因素方差分析和Duncan's多重檢驗(yàn)確定各實(shí)驗(yàn)組間的顯著性差異對(duì)比測(cè)試。顯著性水平設(shè)為P<0.05。

表1 引物和核苷酸序列

結(jié)果

PS-MPs-表征

在本研究中，PS-MP微珠的掃描電鏡圖像呈球形粒徑范圍為103-113 nm(0.103-0.113μm)(圖1a)。的紅外光譜PS-MPs微珠的光譜顯示了聚苯乙烯基團(tuán)的存在(圖1b)，驗(yàn)證制造商的數(shù)據(jù)。從圖S1中，尺寸為PS-MPs的分布圖顯示了PS-MPs的平均粒徑分布為116.5 nm(0.116μm)。

圖1 本研究使用的PS-MPs (0.1 μm)的SEM圖像(a)和FT-IR光譜(b)。

氧化應(yīng)激指數(shù)

與對(duì)照組相比，PS-MPs(10μg L?1和100μg L?1)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值顯著誘導(dǎo)(P<0.001)ROS產(chǎn)生，時(shí)間和劑量-獨(dú)立于本研究(圖2a)。類(lèi)似地，所描述的結(jié)果圖2b顯示了顯著性(P<0.001)中LPO水平的誘導(dǎo)PS-MPs組(10μg L?1和100μg L?1)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)μg L?1)。

圖2 PS-MPs暴露對(duì)活性氧的影響(a);脂質(zhì)過(guò)氧化(b);過(guò)氧化氫酶(c);超氧化物歧化酶(d);谷胱甘肽過(guò)氧化物(e);gluta-硫代s-轉(zhuǎn)移酶(f);堿性磷酸酶(g);乳酸脫氫酶(h);乙酰膽堿酯酶(i)在斑馬魚(yú)鰓中超過(guò)35天的水平。值是表示為±SEM。P<0.05-有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001)和P>0.05-不顯著(#)。

抗氧化生物標(biāo)志物

與對(duì)照組相比，PS-MPs(10μg L?1和100μg L?1)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值顯著(P<0.05)抑制本研究中CAT活性(圖2c)除低劑量組(10μg·kg-1·d-1)在第7天和第14天除外L?1)。同樣，SOD活性顯著升高(P<0.05)抑制PS-MPs組(10μg L?1和100μg L?1)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)對(duì)照(圖2d)。而低劑量組SOD活性(10μg L?1)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)在7月底變異的一天。從圖2e,PS-MPs組(10μg L?1和100μg L?1)的GPx活性μg L?1)均顯著(P<0.05)較對(duì)照組降低組。第7天，低、高劑量組(10μg高劑量組(100μg L?1)，第14天，對(duì)照組(100μg L?1)顯著(P>(0.05)GPx活性變化的觀察到的抗氧化劑的減少與劑量成反比以及PS-MPs暴露時(shí)間。結(jié)果如圖2f所示P<p<0.05)，GST活性呈時(shí)間依賴(lài)性增加PS-MPs暴露劑量除第7天外均為低劑量組(10μg L?1)與對(duì)照組比較。

生化酶

在整個(gè)研究期間,AKP活性顯示顯著(P<0.05)下降。PS-MPs組(10μg L?1和100μg L?1)相比如圖2g所示的控制。下降更為明顯PS-MPs暴露劑量和時(shí)間增加。與對(duì)照組，PS-MPs(10μg L?1和100μg L?1)顯著誘導(dǎo)(P<0.001)呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性(圖2 h)。

神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿酯酶(AChE)活性

與對(duì)照組相比，PS-MPs(10μg L?1和100μg L?1)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值顯著(P<0.001)抑制本研究中AChE活性(圖2)。觀察到抑制疼痛的活動(dòng)顯示時(shí)間并呈劑量依賴(lài)性逐漸增加。

基因調(diào)控模式

PS-MPs顯著改變了抗-hcv的轉(zhuǎn)錄譜氧化、乙酰膽堿酯酶和凋亡相關(guān)基因(圖3)cat、sod1、gpx1a(圖3a-c)和ache(圖3e)的表達(dá)模式趨于一致顯著減少(P<0.05)與增加劑量和持續(xù)時(shí)間PS-MPs曝光。然而，觀察到的cat的減少?zèng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組在第7天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，sod1和ache的表達(dá)也減少微不足道(P>低劑量組第7天和第35天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)(10μg L?1)?；騡stp1顯著(P<0.05)上調(diào)高劑量組(100μg L?1)無(wú)明顯變化變化(P>低劑量組(10μg L?1)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)控制(圖3d)。另一方面，基因tnfa,p53,casp3b，gadd45ba,ptgs2a(圖3 f j)顯著(P<0.05)upregu-PS-MPs組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)治療1第7天結(jié)束)。

圖3 PS-MPs暴露對(duì)cat(a)轉(zhuǎn)錄的影響;sod1(b);gpx1a(c);問(wèn)題(d);疼痛(e);tnfa(f);p53(g);casp3b(h);gadd45ba(我);Ptgs2a(j)基因Danio rerio的鰓暴露超過(guò)35天。值表示為±SEM。P<0.05-有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001)和P>0.05-不顯著(#)。

組織學(xué)分析

為了研究PS-MPs誘導(dǎo)的組織學(xué)反應(yīng)，我們分析了PS-MPs誘導(dǎo)的組織學(xué)反應(yīng)PS-MPs暴露7 d和35 d后斑馬魚(yú)鰓組織的變化。作為如圖4a和b所示，對(duì)照組的鰓表現(xiàn)出正常的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)上，如規(guī)則的板層狀結(jié)構(gòu)內(nèi)襯鱗狀上皮細(xì)胞、傳統(tǒng)的柱狀細(xì)胞和正常的填充細(xì)胞心理結(jié)構(gòu)。然而，PS-MPs暴露7 d后，鰓低劑量組(10μg L?1)有動(dòng)脈瘤、毛細(xì)血管擴(kuò)張和壞死細(xì)胞(圖4c)。組織學(xué)病變的發(fā)生增加隨著時(shí)間的增加導(dǎo)致片狀融合后35 d為低劑量組PS-MPs暴露量(圖4d)。同樣,魚(yú)暴露于較高劑量(100μg L?1)時(shí)鰓組織出現(xiàn)異常形態(tài)學(xué)上有破壞的板層結(jié)構(gòu)、動(dòng)脈瘤、上皮提升細(xì)胞也表現(xiàn)出增加7 d后壞死區(qū)35 d PS-MPs曝光劑量和持續(xù)時(shí)間依賴(lài)的方式(圖4e、f)。

圖4 鰓組織的組織瓣。a)正常鰓組織-對(duì)照組(第7天)。b)正常鰓組織-對(duì)照組(第35天)。c)PS-MPs 10μg L?1組(第7天)。d)PS-MPs組:10μg L?1(第35天)。e)PS-MPs組:100μg L?1(第7天)。f)PS-MPs組:100μg L?1(第35天)。CD-細(xì)胞質(zhì)變性，AM-動(dòng)脈瘤，NC-壞死細(xì)胞，LF-板層融合，EL-上皮提升;規(guī)模酒吧-400μm。插圖(刻度桿-100μm)。

討論

塑料在海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)中的存在是一個(gè)全世界嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。荷蘭國(guó)際集團(tuán)(ing)-水生生物對(duì)MPs的吸收可蓄積并造成不利影響氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)發(fā)育抑制、神經(jīng)傳遞故障,內(nèi)分泌失調(diào),免疫疾病等。然而，mps誘導(dǎo)的生理學(xué)數(shù)據(jù)邏輯的反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路在淡水魚(yú)非常有限。因此,本研究說(shuō)明了機(jī)械通路的活性氧誘導(dǎo)毒性轉(zhuǎn)錄的調(diào)制cytoprotective和apoptosis-related基因PS-MPs暴露出來(lái)斑馬魚(yú)。

一般來(lái)說(shuō)，三個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞產(chǎn)生活性氧當(dāng)暴露于任何壓力或在正常情況下。前者是線(xiàn)粒體呼吸鏈產(chǎn)生ROS二是NADPH氧化酶(NOX)介導(dǎo)的ROS釋放。的后者是由幾種酶(細(xì)胞色素P450，環(huán)氧化酶，血紅素加氧酶，脂氧合酶，髓過(guò)氧化物酶酶、單胺氧化酶和黃嘌呤氧化)反應(yīng)。除上述來(lái)源的ROS產(chǎn)生外，還有細(xì)胞因子生長(zhǎng)促進(jìn)劑與不同的受體結(jié)合導(dǎo)致ROS的生成,作為第二信使在不同信號(hào)通路。

在不同類(lèi)型的受體中，TNFRSF(腫瘤壞死因子超家族)是一類(lèi)與腫瘤結(jié)合的細(xì)胞因子受體超家族壞死因子(TNF)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖、分化、衰老和死亡。暴露于PS-MPs的魚(yú)表現(xiàn)出增加的tnfa表達(dá)和ROS水平提示tnfa誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的發(fā)生。顧等人以及Qiang和Cheng最近報(bào)道了ROS的升高治療水平的幼蟲(chóng)和性腺PS-MPs鮐魚(yú)類(lèi)。然而,很少有研究報(bào)道tnfa介導(dǎo)的活性氧活性PS-MPs具有毒性。

PS-MPs中ROS水平升高，tnfα基因表達(dá)上調(diào)在我們的研究中，ROS和tnfa之間存在相關(guān)性的水平。這與Choi等人對(duì)議員的研究結(jié)果相印證治療斑牙鯉。產(chǎn)生的活性氧會(huì)氧化脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和DNA影響代謝途徑。李等記錄一個(gè)相互依存的ROS和法律外包水平的反應(yīng)PS-NPs暴露了日本沼蝦，為我們的研究提供了支持。在這一行中，Huang等記錄了ROS和LPO水平的增加在海洋貽貝micro-PS暴露。Dimitriadi等人觀察到a顯著增加的脂質(zhì)過(guò)氧化作用在斑馬魚(yú)心臟PS-MPs暴露。同樣的,基因的表達(dá)變化已報(bào)道與ROS產(chǎn)生相關(guān)的。LPO增加我們的研究水平可能歸因于DNA加合物的形成(MDA(丙二醛)和HNE(4-羥基壬烯醛))的誘導(dǎo)表觀遺傳修飾,細(xì)胞死亡。

PS-MPs暴露可影響機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制斑馬魚(yú)的Nism?？寡趸烙到y(tǒng)是一系列的抗氧化劑如SOD、CAT、GPx、GSH和GST參與自由基的中和。在我們的研究中，CAT的活性PS-MPs組SOD活性較對(duì)照組明顯降低加熱器。類(lèi)似于酶的活性，貓和sod1基因很有可能PS-MPs組的下調(diào)呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性的方式。在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)和大絨螯蟹(Macro-)中也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果日本Brachium nipponense[15,47]。GPx活性顯著升高減少PS-MPs治療組，這與在PS-MPs暴露的斑馬魚(yú)中，gpx1a的mRNA水平下降。與此同時(shí)，II相抗氧化酶GST水平升高反應(yīng)表明PS-MPs組的催化過(guò)程增加GST在第二階段解毒過(guò)程中。gstp1基因也表現(xiàn)出明顯的突變PS-MPs組的時(shí)間和劑量依賴(lài)性上調(diào)證實(shí)觀察到的酶反應(yīng)。在PS-NPs中也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果暴露pulex Daphnia和PS-MPs暴露網(wǎng)狀Poecilia reticulate。上調(diào)表達(dá)的抗氧化劑也被docu-細(xì)胞對(duì)微塑料誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生反應(yīng)。

氧化應(yīng)激與炎癥過(guò)程密切相關(guān)其中任何一個(gè)過(guò)程的刺激都可能誘發(fā)其他過(guò)程。幾種炎癥反應(yīng)，比如破壞的板層結(jié)構(gòu)，上皮抬升、板層融合、毛細(xì)血管擴(kuò)張、壞死在暴露PS-MPs的魚(yú)鰓組織中觀察到的炎癥標(biāo)志基因tnfa的轉(zhuǎn)錄上調(diào)模式，ptgs2a提示免疫防御機(jī)制的激活對(duì)抗PS-MPs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，在魚(yú)類(lèi)中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。同樣，Wang et al.和Karbalaei的研究等，描述了PS-MPs誘導(dǎo)炎癥在吉爾-到黃褐斑青鳉(Oryzias melastigma)和虹膜魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)的結(jié)構(gòu)。po—tential PS-MPs毒性取決于顆粒大小,種類(lèi),時(shí)間,曝光系統(tǒng)。在這些因素中，粒徑?jīng)Q定PS-MPs在有機(jī)體的毒性。粒子的大小越小，更大的表面積使PS-MPs粒子容易粘附誘導(dǎo)細(xì)胞破裂的細(xì)胞(血細(xì)胞、肝細(xì)胞/上皮細(xì)胞)溫度。這導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而在組織中產(chǎn)生受損的組織結(jié)構(gòu)。

在本研究中，PS-MPs組AKP活性降低表明酶從細(xì)胞溶酶體中被抑制釋放。一般來(lái)說(shuō)，AKP使proin-的毒性部分去磷酸化細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的炎癥分子條件。AKP活性降低抑制去磷酸化引起促炎分子沉積的過(guò)程血流。此外，這刺激免疫反應(yīng)和促炎細(xì)胞因子的釋放。在我們的研究中，我們觀察到抑制AKP活性，同時(shí)上調(diào)tnf-α表達(dá)模式PS-MPs組為PS-MPs的誘導(dǎo)提供了新的證據(jù)丹尼奧的炎癥反應(yīng)。同樣，Zhang等報(bào)道了在溴氰菊酯處理的稀有Gobiocypris rarus中，tnfa和AKP活性的相互作用。

除了觀察到的炎癥反應(yīng)外，還觀察到增加生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因的表達(dá)βa,gadd45ba在PS-MPs處理組顯示遺傳毒性po-PS-MPs的潛能。gadd45ba基因參與調(diào)控幾個(gè)細(xì)胞周期事件，如細(xì)胞存活、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等周期阻滯和細(xì)胞凋亡以及該基因表達(dá)的增加提示PS-MPs組細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活。細(xì)胞凋亡在生長(zhǎng)，組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用所有生物體的炎癥反應(yīng)。觀察到的gadd45ba和P53基因的上調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是顯而易見(jiàn)的從觀察到的PS-MPs暴露的斑馬魚(yú)鰓組織的組織損傷。同樣，Cheng等人觀察到DNA的顯著丟失鎘中p53的完整性和上調(diào)轉(zhuǎn)錄模式暴露“錫拉”paramamosain。p53的基因觸發(fā)器的caspase-信號(hào)通路通過(guò)凋亡相關(guān)分子Bcl-2/Bax、noxa或細(xì)胞色素c激活。在我們的研究中casp3b在PS-MPs組的轉(zhuǎn)錄模式顯示活性增加，提示細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究的結(jié)果研究結(jié)果與Karami等和Choi等一致表明MPs引起了Danio rerio的DNA損傷和凋亡Cyprinodon生物學(xué)特性。

胞質(zhì)酶LDH,丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸厭氧產(chǎn)能過(guò)程。改變的LDH反應(yīng)是能量代謝中異生物干預(yù)的指征引起細(xì)胞死亡/損傷。PS-MPs中LDH水平升高分組表明能量產(chǎn)生受損導(dǎo)致嗜睡游泳活動(dòng)。游泳速度下降也有報(bào)道暴露于PS微球的斑馬魚(yú)和金魚(yú)Carassius auratus接觸議員。穿過(guò)魚(yú)體內(nèi)血腦屏障的形成可能是導(dǎo)致這種行為的原因改變。也可能導(dǎo)致嗜睡的游泳模式從PS-MPs處理的斑馬魚(yú)中AChE活性的抑制。這抑制引起神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙，導(dǎo)致乙?；憠A(ACh)在突觸處積聚，引起膽堿能的阻塞神經(jīng)傳遞。

許多研究者證實(shí)了MPs的凋亡作用魚(yú)。然而，參與的分子機(jī)制在PS-MPs暴露的組織中誘導(dǎo)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡魚(yú)的特征還沒(méi)有被很好地確定。目前的研究結(jié)果表明PS-MP通過(guò)產(chǎn)生過(guò)剩的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激減少抗氧化劑的產(chǎn)生。隨后，兩者之間的差異ROS的產(chǎn)生和抗氧化防御，導(dǎo)致氧化損傷并改變凋亡相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致提供生理機(jī)能。圖5總結(jié)了分子事件三角函數(shù)在斑馬魚(yú)中由PS-MPs標(biāo)記。我們假設(shè)PS-MPs誘導(dǎo)ROS影響氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)傳遞斑馬魚(yú)。此外,活性氧誘導(dǎo)刺激了p53凋亡產(chǎn)生DNA損傷和炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)激活這從斑馬魚(yú)的鰓組織中很明顯。

圖5 PS-MPs誘導(dǎo)斑馬魚(yú)細(xì)胞凋亡的機(jī)制:一般情況下，PS-MPs或未結(jié)合的苯乙烯(之后形成苯乙烯氧化物)進(jìn)入細(xì)胞并通過(guò)cytp450,GSH和GST酶的作用來(lái)解毒。這種線(xiàn)粒體解毒導(dǎo)致ROS生成，進(jìn)而刺激LPO釋放MDA和HNE。這會(huì)導(dǎo)致DNA加合物的形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，產(chǎn)生的ROS可上調(diào)p53基因的轉(zhuǎn)錄打開(kāi)casp3b激活開(kāi)關(guān)。活化的casp3b促進(jìn)gadd45ba的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞凋亡。這導(dǎo)致組織損傷導(dǎo)致ptgs2a和tnfa表達(dá)增加，LDH酶釋放。另一方面，產(chǎn)生的ROS下調(diào)了細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞保護(hù)基因cat、sod1、gpx1a以及解毒基因gstp1的表達(dá)上調(diào)，從而影響抗氧化劑的翻譯。

結(jié)論

綜上所述，p53誘導(dǎo)凋亡途徑明顯酶的失調(diào)是導(dǎo)致各種生理變化的原因，PS-MPs處理斑馬魚(yú)的反應(yīng)。此外，還有一些基因參與細(xì)胞保護(hù)和炎癥反應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)失調(diào)失調(diào)目前的研究為我們提供了深入的見(jiàn)解PS-MPs誘導(dǎo)斑馬魚(yú)凋亡的毒性機(jī)制及進(jìn)一步研究PS-MPs干預(yù)代謝途徑的研究可能是可行的研究。

基金：我們感謝DRDO-BU生命科學(xué)中心主任Bharathiar大學(xué)校園哥印拜陀，印度提供實(shí)驗(yàn)室和儀器設(shè)備。

本文章原文：Chemico-Biological Interactions 345 (2021) 109550

詳細(xì)網(wǎng)址：https://doi.org/10.1016/j.cbi.2021.109550

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