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文獻推薦 | CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚rpl15基因?qū)Π唏R魚紅系造血發(fā)育的影響

來源:http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.202010180 | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-10-23 | 1057 次瀏覽 | 分享到:

[摘要] 目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚rpl15基因，探討rpl15基因?qū)Π唏R魚紅系造血發(fā)育的影響。方法針對斑馬魚rpl15基因設(shè)計并制備gRNA(guide RNA)，將gRNA與Cas9蛋白的混合物顯微注射到單細胞期斑馬魚受精卵中，提取72 h胚胎基因組DNA，PCR擴增出目的片段，T7E1限制性酶切法檢測基因打靶情況，隨后進行測序分析確定編輯效果。通過O-dianisidine染色分析血紅蛋白合成情況，中性粒細胞染色分析中性粒細胞生成情況，利用Real-time PCR檢測p53、mdm2、hsp70和造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達變化。結(jié)果成功制備了rpl15 gRNA, 并篩選得到rpl15突變體。rpl15基因敲除的幼魚出現(xiàn)體長縮短、尾部彎曲、頭部和眼睛較小及心包水腫的表型；造血相關(guān)譜系染色結(jié)果顯示rpl15突變體血紅蛋白合成明顯減少，但中性粒細胞生成未受影響；rpl15突變體p 53和mdm2的mRNA表達均顯著升高(P < 0.01，P < 0.05, )，α-globin、gata1和hsp70的mRNA表達均顯著下調(diào)(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05)，除紅系外的造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達與對照組相比均無明顯差異。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了斑馬魚rpl15基因，突變體產(chǎn)生了類似先天性純紅細胞再生障礙性貧血疾病的表型。同時表明p53與hsp70可能參與調(diào)控突變體表型的形成。

彭濤1,2, 周唯君1,2, 劉含1,2, 趙硯馳1,2, 李化1,2, 張鵬1,2, 周艷華1,2, 舒莉萍1,2

1. 550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)細胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州省再生醫(yī)學(xué)重點實驗室;
2. 550004 貴陽，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細胞轉(zhuǎn)化研究重點實驗室

收稿: 2020-10-27；修回: 2021-01-04

基金項目: 國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(31860325)；貴州省科技計劃項目(黔科合基礎(chǔ)【2020】IY092)

通信作者: 舒莉萍，E-mail：gyslp456@gmc.edu.cn

[關(guān)鍵詞] CRISPR/Cas9 rpl15基因 DBA 斑馬魚

Effects of rpl15 gene knockout by CRISPR/Cas9 on zebrafish erythroid hematopoietic development

PENG Tao1,2, ZHOU Weijun1,2, LIU Han1,2, ZHAO Yanchi1,2, LI Hua1,2, ZHANG Peng1,2, ZHOU Yanhua1,2, SHU Liping1,2

1. National&Guizhou Joint Engineering Laboratory for Cell Engineering and Biomedicine Technique, Guizhou Provincial Key Laboratory of Regenerative Medicine, Department of Immunology, School of Basic Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004;
2. Key Laboratory of Adult Stem Cell Translational Research, Chinese Academy of Medical Sciences, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China

Supported by the Regional Program of National Natural Science Foundation of China (31860325) and the Project of Science and Technology Plan of Guizhou Province (2020-IY092)

Corresponding author: SHU Liping, E-mail: gyslp456@gmc.edu.cn.

[Abstract] Objective To determine the effect of knocking out zebrafish rpl15 gene by CRISPR/Cas9 editing technique on zebrafish erythroid hematopoietic development. Methods Guide RNA was designed and prepared for rpl15 gene of zebrafish and the mixture of gRNA and Cas9 protein was microinjected into zebrafish zygote at single cell stage. Genomic DNA was extracted after 72 h and the target fragment was amplified by PCR. Editing effect was evaluated by T7E1 restriction enzyme digestion of the PCR products followed by DNA sequencing. Hemoglobin synthesis was analyzed by O-dianisidine staining, neutrophil production was analyzed by neutrophil staining, and the expression of p53, mdm2, hsp70 and hematopoiesis related transcription factor genes was detected by real-time PCR. Results The rpl15 gRNA was successfully prepared and the rpl15 mutants were selected. The results showed that zebrafish rpl15 gene knockout juveniles showed a phenotype of shortened body length, curved tail, smaller head and eyes, and pericardial edema. Hematopoietic lineage staining showed that hemoglobin synthesis in rpl15 mutant was significantly decreased, but neutrophil production was not affected. The mRNA expression levels of rpl15 mutant p53 and mdm2 were significantly increased (P < 0.01, P < 0.05), while those of α-globin, gata 1 and hsp70 were obviously down-regulated (P < 0.01, P < 0.05, P < 0.05). There were no significant differences between the rpl15 mutant and the control group in the mRNA expression levels of hematopoiesis-related transcription factors except erythroid-related ones. Conclusion The rpl15 gene of zebrafish is successfully edited by CRISPR/Cas9 technique, and the mutant produces a phenotype similar to Diamoncl-Blackfan anemia disease. At the same time, it is suggested that p53 and hsp70 may be involved in regulating the formation of mutant phenotype.

[Key words] CRISPR/Cas9 rpl15 gene DBA zebrafish

核糖體蛋白L15(ribosomal protein L15，RPL15)屬于真核生物核糖體60S亞基的一個組成部分，分布于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，主要定位于核仁并呈點狀分布。RPL15在核仁中的定位有利于核仁結(jié)構(gòu)的形成與維持，也可能參與rRNA的成熟過程[1]。核糖體蛋白除了主要參與蛋白質(zhì)合成過程外，也可通過參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等過程在細胞增殖、凋亡、發(fā)育的調(diào)控和惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮作用。RPL15與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。研究表明，RPL15在胃癌、食管癌、結(jié)腸癌中過度表達[2]，與此相反，在皮膚鱗狀細胞癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中表達卻下調(diào)[3]。極光激酶抑制劑Danusertib可通過負性調(diào)控RPL15這個下游關(guān)鍵靶位點，引起具有紅系分化潛能的K562細胞發(fā)生程序性死亡[4]。與此同時，研究表明RPL15基因被證實在先天性純紅細胞再生障礙性貧血(Diamoncl-Blackfan anemia，DBA)患者中存在突變[5]。但目前RPL15基因在紅系造血發(fā)育疾病發(fā)生發(fā)展中的機制尚未闡述清晰，進一步深入認識RPL15基因?qū)t系造血發(fā)育的作用機制具有重要意義。通過比較發(fā)現(xiàn)人與斑馬魚Rpl15蛋白有79%的同源性，更重要的是斑馬魚體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明及產(chǎn)卵量大等優(yōu)勢，使其成為研究疾病發(fā)生發(fā)展的良好模式生物。近幾年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其系統(tǒng)設(shè)計簡單、成本低廉、快捷高效等優(yōu)點，在斑馬魚基因編輯領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]。因此，本研究選擇斑馬魚為研究對象，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對rpl15基因進行敲除，通過測序篩選陽性突變體，觀察敲除rpl15斑馬魚的表型變化，初步探討了敲除rpl15對斑馬魚紅系造血發(fā)育的影響，為研究rpl15在紅系造血疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Tubingen(本課題組飼養(yǎng))品系野生型斑馬魚，飼養(yǎng)于28.5 ℃恒溫自動循環(huán)水系統(tǒng)中，光暗周期比為12 h ∶12 h。取雌雄斑馬魚按1 ∶(1~2) 的比例放入產(chǎn)卵缸內(nèi)，用隔板分隔開，次日光照10 min后拔板，0.5 h后收集受精卵，胚胎置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒pSP6-2sNLS-spCas9由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海血液病研究所袁浩博士惠贈；轉(zhuǎn)錄試劑盒(MEGAshortscript T7 Transcription kit)、mRNA純化試劑盒(mirVanaTM miRNA isolation kit)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)和Cas9蛋白(TrueCutTM Cas9 Protein v2)試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；T7E1限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)公司；PCR引物、DNA序列及DNA Marker購自Invitrogen公司；PCR試劑盒和普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色試劑盒、斑馬魚中性粒細胞染色試劑盒購自蘇州木芮生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

超微量分光光度計(NanoDrop one)購自Thermo Fisher Scientific公司；顯微注射儀(PLI-100)購自Harvard Apparatus公司；Real-time PCR儀(C1000)購自Bio-Rad公司；體式顯微鏡(SMZ645)購自Nikon公司。

1.2 斑馬魚rpl15基因敲除

1.2.1 gRNA靶位點及鑒定引物設(shè)計

根據(jù)靶位點預(yù)測網(wǎng)站http://crispr.dbcls.jp/預(yù)測符合設(shè)計條件的rpl15基因的gRNA。隨后通過靶位點評估網(wǎng)站http://www.oligoevaluator.com/，在斑馬魚rpl15第一外顯子和第三外顯子處選取5個沒有脫靶且高效的靶位點(表 1)。同時設(shè)計各靶序列的鑒定引物。

表 1 rpl15 gRNA靶位點核苷酸序列

靶位點	序列(5′→3′)	位置
gRNA1	GGCCTTGTATCCCAGTCTACGGG	1號外顯子上
gRNA2	GGGAGCGTACAAGTATATGCAGG	1號外顯子上
gRNA3	ACCAGATAAAGCCCGTAGACTGG	1號外顯子上
gRNA4	CCAGATAAAGCCCGTAGACTGGG	1號外顯子上
gRNA5	GGTCCTGAACTCCTACTGGGTGG	3號外顯子上
_：PAM序列

1.2.2 gRNA的制備

采用PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄的方法合成gRNA。具體方法如下：在選取的靶位點序列前方添加T7啟動子序列5′-TAATACGACTCACTATA-3′及識別堿基G，后方添加部分骨架序列5′-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，然后以上述合成pT7-gRNAn (n=1、2、3、4、5) DNA片段作為正向引物(表 2)，反向引物為gRNA骨架通用引物PRgRNA：5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGT-3′。以pSP6-2sNLS-spCas9質(zhì)粒作為模板，通過PCR擴增出轉(zhuǎn)錄所需DNA片段，PCR反應(yīng)條件為94 ℃，3 min; 30×(94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min)；72 ℃，5 min，4 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳及測序檢測PCR產(chǎn)物是否正確，將測序結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄gRNA。純化回收轉(zhuǎn)錄的gRNA并進行濃度測定，gRNA原液分裝凍存于-80 ℃。

表 2 制備gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板正向引物序列

靶位點	序列(5′→3′)
gRNA1	TAATACGACTCACTATAGGGCCTTGTATCCCAGTCTACGTTTTAGAGCTAG
gRNA2	TAATACGACTCACTATAGGGGAGCGTACAAGTATATGCGTTTTAGAGCTAG
gRNA3	TAATACGACTCACTATAGACCAGATAAAGCCCGTAGACGTTTTAGAGCTAG
gRNA4	TAATACGACTCACTATAGCCAGATAAAGCCCGTAGACTGTTTTAGAGCTAG
gRNA5	TAATACGACTCACTATAGGGTCCTGAACTCCTACTGGGGTTTTAGAGCTAG
_：靶位點序列

1.2.3 gRNA有效性的驗證

分別將Cas9蛋白(250~300 pg/nL)與gRNA (25~35 pg/nL)等體積混勻后顯微注射到單細胞期野生型Tuebingen品系斑馬魚受精卵中。每個gRNA靶點注射200枚斑馬魚單細胞期受精卵，每枚受精卵注射1~2 nL混合物。同時留取100枚注射等量體積DEPC水的同批胚胎作為對照。取受精后小時數(shù)(hours post-fertilization, hpf) 為72~96的F0存活胚胎和對照組存活胚胎各10枚，提取各組胚胎基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用相應(yīng)鑒定引物進行PCR反應(yīng)(表 3)，得到的PCR產(chǎn)物進行純化回收。T7E1酶切檢測敲除效率，將發(fā)生突變的PCR產(chǎn)物送TA克隆測序，檢測每條魚體細胞主要的突變類型。

表 3 rpl15 gRNA靶位點突變鑒定引物序列

靶位點	引物序列(5′→3′)	片段大小/bp
gRNA1	上游: GCATCATGGGAGCGTACAAG	266
	下游: GAGATCGTAGTGGACCACCC
gRNA2	上游: ATGTCAGAATCGTGGTCGGC	436
	下游: GAGCCCGATGAAGGGAAGAC
gRNA3	上游: GCATCATGGGAGCGTACAAG	266
	下游: GAGATCGTAGTGGACCACCC
gRNA4	上游: GCATCATGGGAGCGTACAAG	266
	下游: GAGATCGTAGTGGACCACCC
gRNA5	上游: GCCATGGCTTCTGTTTACGGT	345
	下游: CCGCCGATGGTAAGGTGAAA

1.2.4 斑馬魚突變體的篩選

將有效的gRNA和Cas9蛋白混合物顯微注射入野生型(wild type, WT)斑馬魚單細胞期受精卵中，于48~72 hpf在體式顯微鏡下觀察并記錄異常表型。用50 mmol/L的NaOH和1 mol/L的Tris-HCL提取單個具有明顯突變表型斑馬魚胚胎的基因組，用相應(yīng)鑒定引物進行PCR反應(yīng)。擴增產(chǎn)物送測序確認體細胞突變類型。

1.3 rpl15突變體表型的驗證

1.3.1 O-dianisidine染色檢測斑馬魚體內(nèi)血紅蛋白表達

收取48 hpf和72 hpf的野生型及rpl15突變型幼魚各10尾，采用斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色試劑盒進行檢測，具體方法參考試劑盒說明書。

1.3.2 斑馬魚中性粒細胞染色檢測斑馬魚體內(nèi)中性粒細胞生成情況

收取72 hpf的野生型及rpl15突變型幼魚各10尾，采用斑馬魚中性粒細胞染色試劑盒進行檢測，具體方法參考試劑盒說明書。

1.3.3 qRT-PCR檢測rpl15突變體基因表達

收集72 hpf的野生型和rpl15突變型幼魚各10尾，分別提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對斑馬魚原始造血干細胞轉(zhuǎn)錄因子scl、定向造血干細胞轉(zhuǎn)錄因子c-myb、髓系轉(zhuǎn)錄因子pu. 1、紅系轉(zhuǎn)錄因子gata 1、中性粒細胞轉(zhuǎn)錄因子mpo、巨噬/單核細胞轉(zhuǎn)錄因子l-plastin、淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子rag 1、α-globin、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，hsp 70)、抑癌基因p53和雙微染色體2基因(murine double mimute 2，mdm 2)及內(nèi)參基因gapdh設(shè)計qRT-PCR引物(表 4)。

表 4 qRT-PCR引物序列

待測基因	引物序列(5′→3′)	片段大小/bp
p53	上游: CCCGGATGGAGATAACTTG	151
	下游: CACAGTTGTCCATTCAGCAC
scl	上游: CTATTAACCGTGGTTTTGCTGG	145
	下游: CCATCGTTGATTTCAACCTCAT
c-myb	上游: GCCCCCAGTATTGCTCACTT	96
	下游: GCATCGGGCACAGTTTGTTT
pu.1	上游: AGAGCTACAAAGCGTGCAGT	85
	下游: CCTGGGTCCATGAAATGGCT
mpo	上游: GTTTAGCAAGGGTGCGCAAA	394
	下游: CCTTTTGGCTGAGAAACGGC
l-plastin	上游: GAAGCTCTGATCGCTCTGCT	129
	下游: GTTGTTGATTTTGGGGCATC
rag1	上游: GTATGGGAGACGTCAGCGAG	237
	下游: CTGCTACCACAGGTCCCAAG
α-globin	上游: TGCTCTCTCCAGGATGTTG	160
	下游: TCCGGCATTAAGGTCATC
mdm2	上游: AAGCAGTGATCCTGAGAGTTC	157
	下游: ATCCGAAGACTCGCTGTTC
gata1	上游: GTCCAGTTCGCCAAGTTTAC	97
	下游: GGGTTGTAGGGAGAGTTTAG
hsp70	上游: ACCTCTTCAGGGGAACACTA	78
	下游: TGTCGTGGATCTGAGCCTTG
gapdh	上游: AGGCAGAAGGCGGCAAAC	124
	下游: AAGACACCAGTAGACTCCACAAC

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

各實驗至少重復(fù)3次，使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 成功制備gRNA

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，成功轉(zhuǎn)錄出gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4及gRNA5(圖 1)。超微量分光光度計測定gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4及gRNA5濃度分別為85、101、50、83及76 ng/μL。

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圖1 體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA

M: DNA標準(DL600)；1: rpl15-gRNA1；2：rpl15-gRNA2；3：rpl15-gRNA3；4：rpl15 -gRNA4；5：rpl15 -gRNA

2.2 分析rpl15 -gRNA5有效性

將gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4及gRNA5與Cas9蛋白混合物顯微注射到斑馬魚單細胞期受精卵，提取72 hpf胚胎(10枚/組)基因組，并進行鑒定DNA片段的擴增。T7E1酶切純化后的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示僅有g(shù)RNA5有效(圖 2A)。同時PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示在rpl15 -gRNA5靶位點(黑色框所標注序列)附近出現(xiàn)重疊峰(圖 2B)，確定rpl15 -gRNA5可有效誘導(dǎo)靶位點發(fā)生突變。采用gRNA5和Cas9蛋白混合物批量顯微注射斑馬魚單細胞期受精卵，孵育3~5 d收集胚胎提取DNA并利用gRNA5靶位點鑒定引物進行PCR，將擴增產(chǎn)物進行TA克隆測序，篩選出有移碼突變的F0代斑馬魚并檢測體細胞主要的突變類型，顯示靶位點附近有插入、缺失及單個堿基突變(圖 2C)。

圖 2 測序及T7E1酶切檢測gRNA5的作用

A: T7E1酶切鑒定gRNA5靶位點發(fā)生突變M: DNA標準(DL 600)；1:野生型斑馬魚組；2: gRNA5/Cas9蛋白混合物注射組；B: PCR產(chǎn)物測序峰圖WT: 野生型斑馬魚組；MU(MIX) : gRNA5/Cas9混合物注射組；黑色方框標記gRNA5靶位點序列；黑色線標記基因組序列開始突變的位置；C: 代表性體細胞突變類型下劃線表示靶位點序列；綠色表示PAM序列；黃色表示單個突變后的堿基；藍色表示插入堿基；紅色虛線表示缺失堿基

2.3 篩選出rpl15突變體

顯微注射rpl15 -gRNA5和Cas9蛋白混合物到斑馬魚單細胞期受精卵，提取具有明顯異常表型斑馬魚胚胎的基因組并進行PCR，擴增產(chǎn)物送測序。結(jié)果顯示具有明顯異常表型的斑馬魚胚胎均為rpl15基因突變體，其中包括MU1突變體(圖 3A)。通過比對氨基酸序列及移碼突變在Rpl15蛋白的位置(圖 3B)，確定MU1突變屬移碼突變，且突變體只翻譯了120個氨基酸，破壞了Rpl15的功能域。以上結(jié)果表明通過顯微注射rpl15-gRNA5和Cas9蛋白混合物可成功篩選得到rpl15基因突變體。因此，后續(xù)將選擇具有明顯突變表型的斑馬魚胚胎進行相關(guān)實驗。

圖 3 斑馬魚rpl15突變體的鑒定

A：gRNA5作用靶位點測序結(jié)果WT：野生型斑馬魚；MU1：rpl15突變體；黑色方框標記靶位點序列；B：rpl15突變型氨基酸序列及其所在蛋白質(zhì)序列位置WT：野生型斑馬魚序列；MU1：rpl15突變體序列；紅色方框表示第1個產(chǎn)生移碼突變的氨基酸是第119位氨基酸；121位氨基酸(終止密碼子)表示突變體翻譯到這個位點終止，藍色實線表示移碼突變發(fā)生在Rpl15蛋白功能結(jié)構(gòu)域中

2.4 rpl15突變體的表型變化

通過對比觀察野生型和突變型斑馬魚的發(fā)育形態(tài)發(fā)現(xiàn)，突變型斑馬魚胚胎，在受精后有明顯的發(fā)育延遲，達到相同的發(fā)育時期較野生型斑馬魚晚3~4 h。突變型斑馬魚胚胎于48、72、96 hpf均表現(xiàn)出明顯的形態(tài)異常，具體包括體長縮短、向腹側(cè)彎曲的尾巴、頭部和眼睛較小及心包水腫(圖 4A)。約95%的突變型斑馬魚于7~10 d發(fā)生死亡(圖 4B)。

圖 4 rpl15突變對斑馬魚表型影響(×40)

A：rpl15突變型胚胎48、72及96 hpf表型黑色箭頭示“心包水腫”改變部位；紅色箭頭示尾部彎曲部位；e：眼睛部位；B：突變型胚胎生存曲線；C：72 hpf時突變型和野生型斑馬魚血紅蛋白染色結(jié)果統(tǒng)計數(shù)值表示不同血紅蛋白減少程度的胚胎數(shù)量，與野生型比較O-dianisidine染色陽性結(jié)果程度分為正常(黑色)、中度減少(灰色)和重度減少(白色)3個水平，野生型組斑馬魚O-dianisidine染色均呈正常陽性結(jié)果；D：48 hpf和72 hpf突變型及野生型斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色結(jié)果黑色箭頭示染色結(jié)果區(qū)域

48 hpf和72 hpf斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色顯示，突變型斑馬魚較野生型斑馬魚的血紅蛋白染色陽性情況明顯減少(圖 4C、D)。

2.5 rpl15突變體造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化

血紅蛋白染色發(fā)現(xiàn)rpl15敲除后斑馬魚存在血紅蛋白合成減少的現(xiàn)象，通過比較rpl15敲除前后scl、c-myb、pu. 1、gata1、mpo、l-plastin、rag1和α-globin的mRNA水平的表達變化，進一步驗證斑馬魚rpl15突變體對紅系造血發(fā)育的影響是否具有特異性。結(jié)果顯示，突變型胚胎的gata 1和α-globin的表達水平較野生型胚胎顯著下調(diào)(P < 0.05，P < 0.01)；突變型胚胎的scl、c-myb、pu. 1、mpo、l-plastin和rag 1的表達水平較野生型胚胎差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖 5A)。斑馬魚中性粒細胞染色結(jié)果顯示，rpl15突變型胚胎與野生型胚胎染色結(jié)果無明顯差異(圖 5B)。表明rpl15突變體對斑馬魚紅系造血發(fā)育的損害具有特異性。

圖 5 rpl15突變體對斑馬魚造血發(fā)育的影響(×40)

A：造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平變化WT：72 hpf的野生型魚；MUT：72 hpf的rpl15突變型斑馬魚；a：P < 0.05, b：P < 0.01，與野生型比較；B：斑馬魚中性粒細胞染色結(jié)果黑色箭頭示染色結(jié)果陽性區(qū)域

2.6 rpl15突變體紅系發(fā)育相關(guān)分子通路的變化

通過比較rpl15敲除前后gata 1分子伴侶hsp70、p53和mdm2的mRNA水平的表達變化，來分析rpl15突變損害斑馬魚紅系發(fā)育的相關(guān)調(diào)控機制。結(jié)果顯示，突變型胚胎的p53和mdm2的表達水平較野生型胚胎顯著增加(P < 0.01，P < 0.05)；hsp 70表達顯著下調(diào)(P < 0.05，圖 6)。初步表明p53相關(guān)通路及gata1分子伴侶hsp70可能參與了rpl15缺失對斑馬魚紅系造血影響的調(diào)控。

圖 6 Real-time PCR檢測rpl15突變胚胎p53、mdm2、hsp70的mRNA表達水平

WT: 72 hpf的野生型斑馬魚；MUT：72 hpf的rpl15突變型斑馬魚；a: P < 0.01, b: P < 0.05，與野生型比較

3 討論

人的RPL15基因突變已在先天性純紅細胞再生障礙性貧血患者中被發(fā)現(xiàn)。迄今為止幾乎所有驅(qū)動DBA遺傳病變的基因均在核糖體蛋白基因家族中被發(fā)現(xiàn)。因此，DBA被認為是一種核糖體疾病。近些年，與DBA疾病相關(guān)的核糖體蛋白突變研究在小鼠上陸續(xù)開展。目前，利用Cre/loxP系統(tǒng)策略成功構(gòu)建了條件性敲除Rps19、Rpl11基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，表現(xiàn)出與DBA患者相似的生長遲緩和貧血的表型[8]。然而，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型存在實驗周期長、成本高和不適用于對潛在治療藥物進行高通量篩選的缺點。與小鼠相比，斑馬魚則憑借胚胎透明、易于觀察、產(chǎn)卵量大和發(fā)育快的優(yōu)勢，使其成為觀察早期造血發(fā)育和用于大規(guī)模篩選潛在治療藥物的理想模型。目前，利用嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(morpholino，MO)技術(shù)下調(diào)rps19、rpl5、rpl35A、rps24和rps7基因均較好地重現(xiàn)了DBA表型[9-11]。同時利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也成功構(gòu)建了rpl11、rps9和rps29基因突變的DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型[12-14]。鑒于rpl15在DBA疾病發(fā)生發(fā)展中的機制研究仍不明確，且在斑馬魚上rpl15敲除模型的建立仍有空缺，因此本課題致力于研究rpl15對斑馬魚造血的影響，從而進一步探究其在DBA發(fā)生發(fā)展中的機制作用。

本研究利用CRISPR/Cas9定向基因編輯技術(shù)敲除斑馬魚rpl15基因，共設(shè)計了5條gRNA，分別與Cas9蛋白共注射到單細胞期斑馬魚受精卵中。結(jié)果顯示，gRNA5對rpl15具有高效的編輯作用。通過批量顯微注射gRNA5/Cas9蛋白混合物到單細胞期斑馬魚受精卵中，成功篩選獲得rpl15突變體。其中包括MU1突變型個體，該個體產(chǎn)生了移碼突變且提前終止翻譯，從而破壞了Rpl15的功能域。研究表明，已建立的DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型具有頭部發(fā)育不全、尾巴彎曲、體長縮短、心包水腫和體內(nèi)血紅蛋白合成減少等表型。與之前結(jié)果相一致，本研究在rpl15突變體也觀察到了相同的表型，而且rpl15突變體表現(xiàn)出了更為嚴重的心包水腫現(xiàn)象。這與研究報道的人RPL15基因突變的DBA患者出現(xiàn)非常嚴重的早期胎兒水腫癥狀一致[15]。此外本研究證實rpl15突變體原始造血干細胞轉(zhuǎn)錄因子scl、定向造血干細胞轉(zhuǎn)錄因子c-myb、髓系轉(zhuǎn)錄因子pu. 1、中性粒細胞轉(zhuǎn)錄因子mpo、巨噬/單核細胞轉(zhuǎn)錄因子l-plastin及淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子rag 1的mRNA表達水平與對照組相比無明顯差異，同時中性粒細胞染色也證實rpl15突變型胚胎與野生型胚胎的中性粒細胞生成情況無明顯差異，但紅系轉(zhuǎn)錄因子gata 1和α-globin的mRNA表達水平與對照組相比均顯著下調(diào)，提示rpl15突變體特異性的損害了斑馬魚紅系造血發(fā)育。這些結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯斑馬魚rpl15構(gòu)建DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型具有重要意義。

斑馬魚DBA疾病相關(guān)模型研究報道證實，核糖體突變體胚胎形態(tài)發(fā)育異常及貧血表型的形成與p 53通路密切相關(guān)。大量研究證實在斑馬魚DBA疾病相關(guān)模型中下調(diào)p53均可一定程度挽救突變體形態(tài)發(fā)育上的缺陷。同時研究發(fā)現(xiàn)抑制p53的表達可以部分挽救rpl18、rpl11和rps9等突變體中紅系造血發(fā)育的缺陷[13, 16]。本研究結(jié)果顯示，rpl15突變體p53和mdm2基因的mRNA水平顯著增高。當(dāng)rpl15發(fā)生突變時，會導(dǎo)致游離核糖體蛋白在核仁內(nèi)累積，從而與mdm2發(fā)生結(jié)合[17]。在與上述游離核糖體蛋白結(jié)合后，Mdm2泛素連接酶的活性受到抑制，而這會激活p53的表達，從而導(dǎo)致相應(yīng)細胞周期停滯和凋亡的發(fā)生[18]。表明p53通路可能在斑馬魚rpl15突變體表型的形成中發(fā)揮重要作用。此外研究表明，紅系分化過程中HSP70可從細胞質(zhì)遷移到細胞核，以保護GATA1免受caspase-3介導(dǎo)的分裂，從而正常調(diào)控紅系分化發(fā)育[19-20]。本研究結(jié)果顯示，rpl15突變體的gata1、hsp70的mRNA水平顯著下調(diào)。hsp70轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可能將導(dǎo)致Gata1受到caspase-3的裂解，從而致使rpl15突變體的紅系造血發(fā)育受損。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯斑馬魚rpl15基因，可以獲得具有形態(tài)發(fā)育異常并伴有貧血表型的突變體。初步認為p 53通路和hsp70可能參與調(diào)控rpl15突變體表型的形成，有助于進一步探究rpl15在相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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